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Development and validation of a rapid uplc/ms method for the simultaneous determination of I3C, DIM, and related metabolites and its application to pharmacokinetics studies

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Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 2016年第7期25卷 477-488页

作者： Yury Gomez Hu Wang Ah-Ng Tony Kong Graduate Program in Pharmaceutical Science Ernest Mario School of Pharmacy Rutgers The State University of New Jersey Department of Pharmaceutics Ernest Mario School of Pharmacy Rutgers The State University of New Jersey

Indole-3-carbinol(I3C) and diindolylmethane(DIM) are naturally derived dietary phytochemicals with promising anti-cancer properties that have been demonstrated both in vitro and in vivo. Using reversed-phase ultra-performance liquid chromatography(uplc) coupled with mass spectrometry(ms), a rapid, specific, and high throughput method was developed and validated for the quantification and identification of I3 C, DIM, and other I3 C metabolites in plasma. Samples containing I3 C or DIM and the internal standard 4-methoxy indole(IS) were extracted using a liquid-liquid extraction technique. The mean recovery was 96.21% for I3 C and 108.5% for DIM. Separation was achieved using a Waters Acquity uplc HSS T3, 1.8 μm, 2.1 mm×150 mm column and acetonitrile–water gradient elution. The flow rate was 0.3 m L/min and the run time was 9 min. The limits of detection and quantification for I3 C and DIM were 15 ng/m L and 25 ng/m L, respectively. Calibration curves for I3 C and DIM were linear(r2>0.99) over a concentration range of 0.025–20 μg/m L. Precision, accuracy, and stability analysis fulfilled the CDER guidelines criteria. The method was successfully applied to the determination of the pharmacokinetic parameters of I3 C or DIM after oral, intravenous, or intraperitoneal administration to Sprague Dawley rats. The method described here is superior over existing analytical methods for I3 C and its metabolites in terms of sensitivity, speed, and separation.

关键词： uplc/ms Indole-3-Carbinol Diindolylmethane Pharmacokinetics Single-dose administration Sprague-Dawley Rats

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附子配伍过程中二萜类生物碱在Caco-2小肠吸收细胞模型中吸收转运的uplc/ms研究

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化学学报 2011年第15期69卷 1795-1802页

作者：韩天娇宋凤瑞刘忠英皮子凤刘志强刘淑莹中国科学院长春应用化学研究所长春130022 中国科学院研究生院北京100039 吉林大学药学院长春130021

利用Caco-2细胞单层模型和超高效液相色谱-三重四极杆电喷雾质谱联用方法,考察附子中乌头类生物碱提取物的跨膜转运.在相同浓度的附子乌头类生物碱溶液中,加入干姜、甘草、半夏及浙贝母的水提物(折合药材质量比例为1∶1),系统考察了加... 详细信息

利用Caco-2细胞单层模型和超高效液相色谱-三重四极杆电喷雾质谱联用方法,考察附子中乌头类生物碱提取物的跨膜转运.在相同浓度的附子乌头类生物碱溶液中,加入干姜、甘草、半夏及浙贝母的水提物(折合药材质量比例为1∶1),系统考察了加入前后的表观渗透系数(Papp).结果表明,加入配伍药材后附子中11种二萜类生物碱的Papp发生了明显的变化.干姜、甘草和半夏水提物的加入能够明显地降低二萜类生物碱在小肠中的生物利用度,尤其抑制其中毒性较大的双酯型生物碱的生物利用度;而浙贝母的水提物却在促进吸收和抑制外排两个方面共同作用,使二萜类生物碱的生物利用度明显增加.

关键词： Caco-2单层细胞 uplc/ms 二萜类生物碱附子甘草干姜半夏浙贝母

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基于uplc/ms技术的乳腺癌血清代谢组学研究

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现代肿瘤医学 2011年第12期19卷 2361-2365页

作者：黎莉罗国安卢传坚尹芝南韩凌李莎莎广州中医药大学第二临床医学院中心实验室博士后科研流动站广东广州510120 清华大学化学系北京100084 南开大学生命科学院天津300071

目的:探索乳腺癌患者与健康人血清代谢组学差异,为乳腺癌的鉴定与诊断寻找血清潜在生物标志物,推测乳腺癌的发生机理。方法:利用超高压液相色谱质谱(uplc/ms)技术建立了乳腺癌血清代谢指纹图谱。分别采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法... 详细信息

目的:探索乳腺癌患者与健康人血清代谢组学差异,为乳腺癌的鉴定与诊断寻找血清潜在生物标志物,推测乳腺癌的发生机理。方法:利用超高压液相色谱质谱(uplc/ms)技术建立了乳腺癌血清代谢指纹图谱。分别采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交校正的偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)分析病例组和正常对照组之间的代谢差异。结果:通过变量重要性投影,结合质谱同位素分析和数据库检索筛选鉴定出了9个潜在生物标志物,涉及核苷代谢、磷脂代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢及皮质甾体激素代谢。结论:乳腺癌患者与健康对照人群在血清代谢水平上具有明显差异,差异代谢物的发现有助于为发现乳腺癌诊断的潜在标志物提供依据,推测哪些代谢通路参与了乳腺癌的发生发展,为乳腺癌发病机理研究与个体化治疗提供依据。

关键词：乳腺癌血清代谢组学 uplc/ms

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黄芪桂枝五物汤改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤:药理和代谢组学证据

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南京中医药大学学报 2021年第6期37卷 920-929页

作者：凌金颖王琦范海贞戴婧雅成小兰南京中医药大学附属中西医结合医院江苏南京210028 南京道尔医药科技有限公司江苏南京210012 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院江苏南京210023

目的研究黄芪桂枝五物汤对脑缺血损伤的神经保护作用,并探讨其可能作用机制。方法将50只大鼠随机分为假手术组,模型组及黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组(5、10、20 g·kg^(-1)),每组10只。除假手术组外,大鼠采用线栓法建立大脑中动脉闭... 详细信息

目的研究黄芪桂枝五物汤对脑缺血损伤的神经保护作用,并探讨其可能作用机制。方法将50只大鼠随机分为假手术组,模型组及黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组(5、10、20 g·kg^(-1)),每组10只。除假手术组外,大鼠采用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。中药组大鼠灌胃给予复方水煎液,假手术组和模型组大鼠灌胃给予等量的生理盐水。连续灌胃7 d后,处死大鼠。通过神经功能缺损评分、脑梗死面积、脂质过氧化和炎症细胞因子水平检测来评估各组大鼠脑缺血性损伤程度。同时通过代谢组学研究黄芪桂枝五物汤对脑缺血再灌注损伤的可能机制。结果黄芪桂枝五物汤可显著降低神经功能缺损评分和脑梗死面积,减少脂质过氧化和炎症细胞因子水平,表明其可有效减轻MCAO诱导的大鼠脑缺血性损伤。进一步的代谢组学研究表明,脑缺血再灌注损伤后血清代谢紊乱,共筛选和鉴定出23种与缺血性中风相关的代谢物发生显著性变化,是脑缺血潜在的生物标志物。代谢通路分析显示,MCAO主要通过靶向乙醛酸和二羧酸代谢,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成来诱导脑缺血性损伤。黄芪桂枝五物汤干预后,大部分代谢标记物发生了逆转,主要包括吲哚氧基硫酸、柠檬酸、3-羟基十二酸、3-甲基-2-丁烯酸、苹果酸、丁醛和尿酸等。结论黄芪桂枝五物汤可有效改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,其发挥神经保护作用的机制可能与抑制炎症、改善多种代谢途径有关。

关键词：黄芪桂枝五物汤脑缺血再灌注损伤脑中动脉闭塞代谢组学 uplc/ms

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中空纤维在样品前处理及痕量物质分析中的研究与应用

中空纤维在样品前处理及痕量物质分析中的研究与应用

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作者：刘彦河北医科大学

学位级别：硕士

对于生物样品、环境样品以及药物中的痕量活性成分的分析，由于待分析物的含量通常很低，且样品基质较为复杂、干扰物质相对较多，因而仅依靠采用较高灵敏度的检测方法并不能完全改善待测物质的检出限，若加之采用良好的样品前处理技术... 详细信息

对于生物样品、环境样品以及药物中的痕量活性成分的分析，由于待分析物的含量通常很低，且样品基质较为复杂、干扰物质相对较多，因而仅依靠采用较高灵敏度的检测方法并不能完全改善待测物质的检出限，若加之采用良好的样品前处理技术对待测物质进行分离、纯化及富集，才可以减少基质成分对色谱系统的干扰，并且能够大大地提高检测方法的灵敏度和准确度。因此，建立良好的样品前处理方法，对待测物质进行纯化、富集，以获得快速、简便、高灵敏度的检测方法成为了本文的研究重点。传统的样品前处理技术，如液-液萃取(LPE)，不仅操作繁琐费时，且需使用大量对人体和环境有毒、有害的有机溶剂，难以实现分析操作的自动化，其应用受到了很大限制。现阶段，开发高效省时、有机溶剂用量少的新型样品前处理技术，已成为药物分析领域新的热点课题。固相微萃取(SPME)、悬滴液相微萃取(SD-LPME)，均是近些年发展的新型微型化的萃取技术，但SPME成本高、易产生交叉污染，而SD-LPME的悬滴容易脱落或发生损失，则可导致重现性差。因此，建立快速、廉价、选择性高的样品前处理方法用于微量物质的分析检测是十分必要的。中空纤维液相萃取(HF-LPME)是近年来快速发展的另一种微萃取技术，与上述前处理方法相比， HF-LPME不仅具有富集功效，且使用微量有机溶剂，克服了传统的样品前处理操作繁琐、费时，需大量使用有机溶剂等缺点，已广泛应用于简单样品基质的前处理过程中。然而，采用HF-LPME对复杂的生物样品进行分析的研究仍处于尝试阶段。雌激素及具有雌激素活性的物质可模拟机体内源性雌激素的生理、生化作用，具有拮抗内源性雌激素的效应，因此被称为环境雌激素。这些外源性化学物质进入体内后，干扰体内雌激素的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，造成内分泌系统的功能紊乱，破坏机体内环境的稳定，甚至可导致生殖障碍、发育异常、代谢紊乱以及某类癌症的发生，因此该类物质与某些疾病发生机制之间的关系已引起医学界的广泛关注。牛奶中的雌激素正是环境雌激素的一种，由于近些年来，奶牛饲养方式的改变，牛奶消费量不断增加，牛奶中的雌激素水平也随之升高，且在体内不易降解，因此对人类健康的潜在危害性也越来越大。食物源性雌激素主要为雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)，而雌二醇约占40%，因此，牛奶中E2的检测对于监控奶制品的食用安全是极其重要的。采用HPLC-UV分析牛奶中的雌激素，检测水平仅10-6左右不能较好的满足痕量雌激素的检测，而灵敏度较高的质谱(ms)检测器价格昂贵并不能迅速普及。因此，本课题研究建立了HF-LPME与HPLC-UV联用的方法用于牛奶中E2的分析。所建HF-LPME对牛奶中E2的富集倍数可达200倍，即使采用普通的HPLC-UV，其分析水平便可达到10，大大的提高了分析方法的灵敏度,可用于牛奶中的E2含量分析。已有文献证实，体内E2、E1及其代谢产物水平与乳腺癌、子宫内膜癌等癌症的发生密切相关。然而，由于机体内E2、E1的代谢产物含量极低，常用的分析手段无法胜任，即使采用HPLC-ms，其分析灵敏度仍然不能完全满足分析要求，严重制约了雌激素及其代谢产物水平与癌症发生机制的研究，因此，开发具有高灵敏度的分析方法，是雌激素代谢产物研究的关键问题。本课题将高灵敏度的uplc/ms分析方法结合丹酰氯衍生，进一步提高了雌激素代谢产物分析的灵敏度，同时结合具有富集作用的HF-LPME样品前处理技术，建立了高灵敏的分析雌激素代谢产物的新方法，成功分析了尿样中8种雌激素及其代谢产物的含量。该方法检测灵敏度可达10，加之采用MRM检测模式，不仅干扰少，灵敏度高，且分析时间短、操作相对简单。20例待检子宫内膜癌患者尿样检测结果与20例健康志愿者尿样检测结果研究表明，5种雌激素代谢产物在子宫内膜癌患者与健康人尿样中的含量存在显著性差异，进一步证实了雌激素及其代谢产物含量水平与子宫内膜癌发生机制之间的关系。所建分析方法为临床雌激素及其代谢产物的研究提供了可靠的分析手段。 HF-LPME对生物样品中雌激素及其代谢物的分析，提高了检测灵敏度，展现了其分析复杂基质中痕量、限量待测物质的应用前景，因此也可用于生物样品中某些违禁药物的限量检测，也可用于研究某特殊人群的用药史追溯等领域。麻黄碱类物质是一种具有兴奋作用的限用药品。伪麻黄碱与麻黄碱互为非对映异构体，对人的中枢系统具有兴奋的作用[1]，是感冒药中的常见成分。由于其具有较强的兴奋作用，在体育赛事中会影响竞赛的公平，因此对于赛前运动员，该类药物的使用是有所限制的。此外，该类药物与抗组胺药合用会产生嗜睡、疲倦、头昏等副作用，对于飞行员等特殊群体该类药物也需谨慎服用，FAA(Federal Aviation Administration)中规定该麻黄碱类药物不得与抗组胺药合用，

关键词：中空液相微萃取 HPLC 雌二醇牛奶 HF-LPME uplc/ms 雌激素及其代谢物子宫内膜癌盐酸伪麻黄碱尿样麻黄碱伪麻黄碱

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酒精性肝硬化和乙肝肝硬化患者血清代谢组学初步研究

酒精性肝硬化和乙肝肝硬化患者血清代谢组学初步研究

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作者：连江山浙江大学

学位级别：硕士

研究背景我国肝脏疾病发病率高,根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果,现有的慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例,5年内有10-20%的慢性乙型肝炎将进展为肝硬化。随着我国经济的不断发展,酒精引起的肝炎、肝硬... 详细信息

研究背景我国肝脏疾病发病率高,根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果,现有的慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例,5年内有10-20%的慢性乙型肝炎将进展为肝硬化。随着我国经济的不断发展,酒精引起的肝炎、肝硬化发病率近年也在增加。因此,针对酒精性肝硬化、乙肝肝硬化的早期诊断及发病机制的研究具有十分重要的意义。肝脏是机体最重要的代谢器官,是物质代谢的枢纽。当肝脏发生病理生理改变时,必然会引起与之相关的代谢网络发生相应的变化。代谢组学是系统生物学研究的一个新的平台,在制药工业和临床诊断等方面已得到了广泛和有效的应用。它通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(疾病或环境变化后),其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系。在临床上,代谢组学目前已在一些疾病的诊断、发病机制、预后判断上得到初步研究应用。代谢组学研究常用的技术方法有核磁共振(NMR)气相色谱-质谱(GC/ms)、液相色谱-质谱(LC/ms)。其中超高效液相色谱质谱相对于其他技术更加高效、快速、灵敏,越来越多的应用于代谢组学研究,是一种稳健的代谢组学研究工具。本研究应用线性梯度的超高效液相色谱飞行时间质谱(uplc/TOF/ms)在正离子模式下对酒精性肝硬化、乙肝肝硬化患者的血清进行分析,对获取的数据应用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法聚类分析法(OPLS)进行模式识别,和正常健康组进行比较,探索可用于酒精性肝硬化、乙肝肝硬化早期诊断的血清生物标志物。方法：酒精性肝硬化患者18例,乙肝肝硬化患者19例,、健康对照人群22例,每例各取血清200μl,1：3(v/v)和乙腈混合,涡旋,10000rpm离心10min,取上清液450μl。应用超高效液相色谱质谱(uplc/ms)对酒精性肝硬化患者、乙肝肝硬化患者、健康对照组人群的血清萃取液进行代谢组学分析,结合主成份分析、偏最小二乘法分析等多变量数据分析方法来研究不同原因引起的肝硬化患者血清代谢谱变化,评估代谢谱对不同原因引起的肝硬化及早期肝硬化诊断的有效性。结果：建立了基于uplc/ms的肝硬化患者血清代谢组学诊断模型。应用该技术对酒精性肝硬化患者、乙肝肝硬化患者、健康人血清乙腈萃取液进行代谢组学分析。对正常组与酒精性肝硬化、乙肝肝硬化患者血清代谢组学数据进行主成份分析(principal components analysis,PCA)分析,结果显示正常组与酒精性肝硬化组、正常组与乙肝肝硬化组、酒精性肝硬化组与乙肝肝硬化组的代谢指纹有显著差别。进一步运用有监督的正交偏最小方差判别分析(Orthogonal Partial least squares, OPLS)方法对3组样本进行重新建模,结果显示正常组与不用原因引起的肝硬化组以及酒精性肝硬化和乙肝肝硬化患者之间能够得到更好的区分。说明主成份分析模型、有监督的正交偏最小方差判别分析模型可以用于肝硬化的早期诊断以及酒精性肝硬化和乙肝肝硬化的鉴别诊断。对分组贡献(VIP值)较大的小分子代谢物质(uplc/ms血清代谢组学方法的基础上,通过对酒精性肝硬化患者、乙肝肝硬化患者和健康人群血清代谢组学研究,结合多变量统计分析方法,发现代谢组学技术对肝硬化的诊断具有较好的作用,是临床研究的一个强有力的武器。

关键词：代谢组学血清 uplc/ms 肝硬化多变量分析

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肉苁蓉成分的分离鉴定、定量分析及生物活性研究

肉苁蓉成分的分离鉴定、定量分析及生物活性研究

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作者：王力伟内蒙古大学

学位级别：硕士

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y. C. Ma)为列当科肉苁蓉属多年生根寄生草本植物,是生长在我国西北地区的名贵补益类中药材之一,其入药部分为带鳞片的干燥肉质茎,具有补精血、益肾壮阳、通便润肠等作用。近年来,由于对肉苁蓉的过度攫取... 详细信息

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y. C. Ma)为列当科肉苁蓉属多年生根寄生草本植物,是生长在我国西北地区的名贵补益类中药材之一,其入药部分为带鳞片的干燥肉质茎,具有补精血、益肾壮阳、通便润肠等作用。近年来,由于对肉苁蓉的过度攫取,导致其植物资源遭到严重破坏,现肉苁蓉已经被列为国家二级保护植物。本实验主要以肉苁蓉肉质茎为研究素材,针对其的化学成分分离鉴定、定量及生物活性进行研究。具体结果如下：第一部分：文献综述为了进一步研究、开发和利用肉苁蓉提供详尽的信息,对肉苁蓉属植物的资源分布、药理研究以及化学成分的国内外研究进行了概述。第二部分：肉苁蓉不同萃取部位的化学成分的分离鉴定利用反相硅胶层析、凝胶层析、HPLC制备等分离纯化技术,从肉苁蓉的甲醇提取物中分离得到了26个化合物。运用NMR、 uplc-QQQms等波谱学方法及结合参考文献数据鉴定出它们的化学结构,分别是：2-乙酰-3-鼠李糖基-4-咖啡酰葡萄糖(1)、肉苁蓉苷F(cistanoside F,2)、毛蕊花糖苷(acteoside,3)、异毛蕊花糖苷(isoacteoside,4)、肉苁蓉苷C (cistanoside C,5)、2’-乙酰毛蕊花糖苷(2’-acetylacteoside,6)、松果菊苷(echinacoside,7)、3-甲基-4-羟基-7-苯乙基-0-鼠李糖-(1-3)-2’-O-乙酰基-O-葡萄糖(8)、肉苁蓉苷A (cistanoside A,9)、管花苷A (tubuloside A,10)、cistantubuloside C1/C2 (11)、肉苁蓉苷B (cistanoside B,12)、osmanthuside B (13)、 leonuride (14)、8-表马钱子酸(8-epiloganic acid,15)、格鲁苷(gluroside,16)、巴尔蒂苷(bartsioside,17)、6-去氧梓醇(6-deoxy-catalpol,18)、kankanoside E (19)、玉叶金花苷酸(mussaenoside acid, 20)、kankanoside B (21)、kankanoside O (22)、adenosine(23)、 2,6-Dimethyloctan-1,8-diol diglucoside (24)、对羟基香豆(p-coummaric acid 25)和β-谷甾醇(β-sitosterol 26)。其中化合物1为未见报道的新化合物,化合物24为首次从本属植物中提出的化合物。第三部分：定量分析不同肉苁蓉样品主要成分的含量。利用超高效液相-串联三重四极杆质谱联用法(uplc-QQQms)同时定量检测分析并比较不同产地、不同品种及不同前处理方式的肉苁蓉中14个化合物的含量。研究结果显示：(1) 14种化合物的检测限均小于0.0259μg/mL,定量限均小于0.0629μg/mL。14种标准品在一定范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均大于或等于0.999;方法回收率为100.02%-106.94%;其日内及日间精密度实验的RSD分别为0.97%-2.51%和1.21%-3.27%。该方法灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、准确,可用于不同产地、不同种类及不同前处理方式的肉苁蓉及其相关食品药品的质量控制。(2)同一种肉苁蓉经过不同的干燥方法处理,会导致其成分含量产生明显的差别,冷冻干燥处理的肉苁蓉中的毛蕊花糖苷(acteoside,3)、松果菊苷(echinacoside,7)的含量明显高于人为烘干及自然风干处理的肉苁蓉样品。同时也建立一种灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、准确地肉苁蓉及其相关食品药品的质量控制方法。第四部分：抗氧化活性的研究从肉苁蓉提取物中筛选出10个苯乙醇苷类化合物具有良好的抗清除DPPH游离基活性。其中,肉苁蓉的代表性化合物毛蕊花糖苷(acteoside,3)、松果菊苷(echinacoside,7)也具有良好的抗氧化性,其IC50值分别为14.7和23.4μg/mL。而化合物异毛蕊花糖苷(isoacteoside,4)的抗氧化性最强,其IC50值为1.3μg/mL.

关键词：肉苁蓉化学成分苯乙醇苷抗氧化 uplc/ms 定量分析

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应用分子印迹固相萃取法提取血液中大隆和溴敌隆

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中国法医学杂志 2011年第5期26卷 371-373,376页

作者：常靖郝红霞侯小平张云峰栾玉静公安部物证鉴定中心北京100038 证据科学教育部重点实验室中国政法大学北京100088

目的采用分子印迹固相萃取,uplc/ms分析,检验血液中大隆和溴敌隆。方法以大隆为模板分子,丙烯酰胺为单体,二甲基亚砜为有机溶剂,按照模板分子与单体摩尔配比关系为1∶4合成大隆分子印迹聚合物,作为固相萃取剂萃取血液中大隆和溴敌隆,以2... 详细信息

目的采用分子印迹固相萃取,uplc/ms分析,检验血液中大隆和溴敌隆。方法以大隆为模板分子,丙烯酰胺为单体,二甲基亚砜为有机溶剂,按照模板分子与单体摩尔配比关系为1∶4合成大隆分子印迹聚合物,作为固相萃取剂萃取血液中大隆和溴敌隆,以2×1mL去离子水、1mL 30%甲醇去离子水洗涤杂质,2×1mL 1%甲酸/甲醇洗脱,提取血中目标物后进行uplc/ms分析检测。结果溴敌隆和大隆回收率均在90%以上,在50～500ng/mL浓度范围内线性关系良好r,2溴敌隆为0.998 4,大隆为0.991,检测限(S/N=5/1)低于10ng/mL。结论本方法回收率高,基质效应降低,杂质干扰少,可用于血液中低浓度大隆和溴敌隆的检验。

关键词：法医毒物分析大隆溴敌隆分子印迹固相萃取 uplc/ms

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自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化血清代谢组学初步研究

自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化血清代谢组学初步研究

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作者：刘薇浙江大学

学位级别：硕士

研究背景自身免疫性肝炎(AIH)和原发性性胆汁性肝硬化(PBC)因临床表现的不典型及常有重叠综合征的发生,临床诊断尚存在很多困难,发病机制未明,缺乏特异性化验手段,确诊均需创伤性肝脏穿刺,故寻找其他研究自身免疫性肝病的机制和诊断方... 详细信息

研究背景自身免疫性肝炎(AIH)和原发性性胆汁性肝硬化(PBC)因临床表现的不典型及常有重叠综合征的发生,临床诊断尚存在很多困难,发病机制未明,缺乏特异性化验手段,确诊均需创伤性肝脏穿刺,故寻找其他研究自身免疫性肝病的机制和诊断方法的可能性就显得尤为重要。肝脏为人体最主要的代谢器官,是三大物质代谢的枢纽。肝脏如果有病理生理改变,与之相关的代谢势必会产生相应的变化。代谢组学是属于系统生物学研究的新平台,是通过研究生物体系受到各种扰动后各种代谢物质发生的变化研究生命体。代谢组学研究中较常用的方法包括核磁共振(NMR)、气相色谱一质谱(GC/ms)、液相色谱-质谱(LC/ms)。其中超高效液相色谱-质谱联用技术(uplc)因为高效、灵敏等优点,得到越来越多地的应用。代谢组学目前已在一些疾病的诊断、发病机制、预后判断上得到初步研究应用,如在肾细胞癌,胆管癌,食管癌以及糖尿病的诊断中表现优秀。本研究运用以uplc/ms为基础的血液代谢组学研究方法对AIH和PBC的患者进行了血液代谢组学的初步研究。通过研究自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者与正常人间的血液代谢谱差异,寻找潜在的生物标记物;为临床诊断提供新的思路和方法,并尝试建立AIH与PBC的代谢组学鉴别诊断模型。方法：选择临床诊断为AIH19例和PBC20例患者及正常健康人25例,应用非靶向的线性梯度超高效液相色谱质谱系统检测血清中的小分子代谢物质。对超高效液相色谱-质谱(uplc/ms)的检测数据进行多变量数据分析,建立AIH和PBC鉴别诊断模型,并验证诊断模型的效力。筛选生物标记物,并分析各组血清中生物标志物的变化情况。结果：在负离子模式下自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化的代谢图谱明显不同,构建了可以鉴别诊断AIH和PBC的代谢组学偏最小二乘模型(PLS),该模型解释能力和预测能力都很好(R2Y=0.991,Q2=0.943),ROC曲线下面积为1,包括4例AIH,4例PBC,4例AIH-PBC重叠综合症患者在内的外部验证结果显示,AIH及PBC组分组完全正确,且AIH-PBC重叠症标本位于单独的区域。共鉴定出了6类生物标记物：胆汁酸(bile acids),溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine, LPC),卵磷脂(phosphatidylcholine, PC),鞘磷脂(sphingomyelin,SM),游离脂肪酸(free fatty acids,FFA),苯丙氨酸(Phenylalanine)。胆汁酸在疾病组血清含量升高,LPC,PC,SM,FFA在疾病组降低,PBC血清中以上物质改变程度高于AIH,AIH-PBC重叠症组物质的改变介于AIH与PBC之间。苯丙氨酸仅在AIH组中较健康对照组升高有统计学意义。结论：通过对自身免疫性肝炎患者、原发性胆汁性肝硬化患者和健康人群血清进行代谢组学研究,结合多变量统计分析方法,发现代谢组学技术对自身免疫性肝病的诊断及机制研究具有一定的帮助,是一种值得引起重视的研究疾病诊断和机制的方法。

关键词：代谢组学 uplc/ms 自身免疫性肝炎原发性胆汁性肝硬化多变量分析

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右归饮在正常和肾虚大鼠的入血成分分析及改善肾虚骨质疏松的作用机制

右归饮在正常和肾虚大鼠的入血成分分析及改善肾虚骨质疏松的作用...

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作者：石玉红西南大学

学位级别：硕士

背景右归饮由熟地黄、枸杞子、山茱萸、炒山药、制附子、肉桂、姜杜仲、炙甘草组成,具有阴阳双补,填精补血的功效,主治命门不足,精血亏虚之证。本课题组前期已通过uplc-Q-TOF/ms质谱峰测得右归饮水煎液共有特征峰89个,并确定了其中85个... 详细信息

背景右归饮由熟地黄、枸杞子、山茱萸、炒山药、制附子、肉桂、姜杜仲、炙甘草组成,具有阴阳双补,填精补血的功效,主治命门不足,精血亏虚之证。本课题组前期已通过uplc-Q-TOF/ms质谱峰测得右归饮水煎液共有特征峰89个,并确定了其中85个化学结构明确的成分。也证明了右归饮对肾虚骨质疏松大鼠具有显著的改善作用。但哪些成分可以吸收入血,发挥右归饮“益精生髓”的功效,尚未可知。本文通过血清药物化学、网络药理学和血清药理学相结合,拟研究右归饮入血原型成分改善肾虚骨质疏松的机制。本研究得到西南重庆市科委-计生委联合中医药科技重点项目(zy201801001)的支持。目的1.研究右归饮在正常大鼠和腺嘌呤所致肾虚模型大鼠的入血成分。2.探究右归饮入血成分改善肾虚骨质疏松的作用机制。方法1.右归饮在正常大鼠的入血成分分析方法:(1)uplc-Q-TOF/ms的液质条件:采用色谱柱为Waters ACQUITY uplc BEH-C18(2.1×100mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸-乙腈溶液(A);0.1%的甲酸-水溶液(B);梯度洗脱,柱温:45℃;进样量6μl。质谱条件采用电喷雾电离离子源(ESI),正、负离子模式下采集数据。(2)MRM监测色谱条件:色谱柱为Waters ACQUITY uplc BEH C18(2.1×100mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸-乙腈溶液(A);0.1%的甲酸-水溶液(B);梯度洗脱,流速:0.4 m L·min-1;柱温:35℃;样品室温度:30℃;进样量:6μL。2.腺嘌呤所致肾虚大鼠模型的复制及入血成分分析方法:(1)模型复制:6只SD雄性大鼠每天定时灌胃给予腺嘌呤(150 mg·kg)一次,持续4周。(2)模型成功标准:与正常组相比,观察模型组动物体征形态的变化,肾功能指标肌酐(CREA)、尿素(UREA)的含量显著上升,血清中睾酮(T)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)等指标含量显著下降,即判断模型成功。(3)uplc-Q-TOF/ms的液质条件:采用色谱柱为Waters ACQUITY uplc BEH-C18(2.1×100 mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸-乙腈溶液(A);0.1%的甲酸-水溶液(B);梯度洗脱,柱温:45℃;进样量6μl。质谱条件采用电喷雾电离离子源(ESI),正、负离子模式下采集数据。(4)MRM监测色谱条件:采用色谱柱为Waters ACQUITY uplc BEH C18(2.1×100mm,1.7μm);流动相:0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脱,流速:0.4 m L·min-1;柱温:35℃;样品室温度:30℃;进样量:6μL。3.右归饮在正常大鼠和肾虚大鼠入血成分的比较方法:根据右归饮在正常大鼠和肾虚大鼠的入血结果进行分析,对比两组大鼠通过对照品确定的和通过文献推测的成分有何异同。4.网络药理学筛选右归饮入血成分改善肾虚证9种疾病作用靶点及机制的方法:以右归饮的入血原型成分为切入点通过sea、TCmsP、Swiss Target Prediction、Pharm Mapper四个在线数据库预测入血成分的靶点。通过OMIM、GENECARDS、TTD、CTD四个在线数据库预测肾虚症相关9种疾病靶点。通过韦恩图确定右归饮治疗肾虚9种疾病的潜在作用靶点。在此基础上,利用string平台分析其化合物与疾病靶点的蛋白-蛋白相互作用;利用cytoscape软件进行拓扑学分析,筛选出关键靶点;并使数据可视化,利用string在线数据库进行GO生物分析和KEGG通路分析,找出右归饮治疗肾虚证多种疾病的相关机制,通过cytoscape软件构建网络关系图。5.网络药理学预测右归饮入血成分改善肾虚骨质疏松作用靶点及机制的方法:以右归饮的入血原型成分为切入点通过sea、TCmsP、Swiss Target Prediction、Pharm Mapper四个在线数据库预测入血成分的靶点。通过OMIM、GENECARDS、TTD、CTD四个在线数据库预测肾虚骨质疏松疾病的靶点,通过韦恩图确定右归饮治疗肾虚骨质疏松的潜在作用靶点。在此基础上,利用string平台分析其化合物与疾病靶点的蛋白-蛋白相互作用;利用cytoscape软件进行拓扑学分析,筛选出关键靶点;并使数据可视化,利用string在线数据库进行GO生物分析和KEGG通路分析,预测出治疗肾虚骨质疏松的主要信号通路;实验最后通过cytoscape软件构建网络关系图。6.血清药理学验证右归饮含药血清改善肾虚骨质疏松的作用靶点及通路的方法:(1)用MTT法检测右归饮含药血清对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。(2)采用碱性磷酸酶(A

关键词：右归饮 uplc/ms 血清药物化学网络药理学血清药理学骨质疏松

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