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莱菔硫烷激活ERK/Nrf2通路上调ugt1a表达抑制结直肠癌的癌变

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莱菔硫烷激活ERK/Nrf2通路上调UGT1A表达抑制结直肠癌的癌变

作者：郝倩山东大学

学位级别：硕士

研究背景及目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人体消化系统常见恶性肿瘤之一,其发生及发展存在长期的癌前状态,这为结直肠癌的预防提供了契机。杂环胺类化合物(Heterocyclic amines,HAs)作为一种结直肠癌食源性致癌物,该物质在人... 详细信息

研究背景及目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人体消化系统常见恶性肿瘤之一,其发生及发展存在长期的癌前状态,这为结直肠癌的预防提供了契机。杂环胺类化合物(Heterocyclic amines,HAs)作为一种结直肠癌食源性致癌物,该物质在人体中的分解以及代谢主要通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyltransferase 1A,ugt1a)所介导的葡萄糖醛酸结合反应。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是一种异硫氰酸酯类的植物化学物质,具有抗氧化、抗炎、预防癌症、抗癌等作用。既往研究表明SFN能够上调ugt1a的表达,从而增加杂环胺类化合物的分解代谢。但其中SFN如何上调ugt1a的具体的作用机制尚不明确。本研究旨在前期研究的基础上深入研究SFN诱导ugt1a上调的作用机制,为CRC的基础研究和化学预防提供新的认识。研究方法1.本研究通过MTT实验、细胞集落形成实验及EdU实验,检测了 SFN处理后的CRC细胞(HT-29和SW480)活力和增殖能力。划痕实验及Transwell迁移实验用于检测CRC细胞在不同SFN浓度环境中的迁移能力。2.使用流式细胞术检测了不同浓度SFN作用于CRC细胞后,分析其细胞周期及细胞凋亡变化。3.不同浓度SFN分别处理细胞,通过实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测其 p-ERK、ERK、Nrf2及ugt1a的分子表达,通过细胞免疫荧光技术观察Nrf2的表达及定位。4.设计核因子E2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)短发夹 RNA(shRNA)和阴性对照(Negativecontrol,NC)shRNA,转染于 CRC 细胞中,通过RNA干扰技术得到Nrf2 shRNA及NC shRNA稳转细胞系。分别用含或不含SFN的培养基处理细胞,分为6组:NC shRNA组,NC shRNA+10μmol/LSFN组,NC shRNA+20μmol/LSFN 组,Nrf2 shRNA 组,Nrf2shRNA+10μmol/L 组和Nrf2 shRNA+20μmol/L SFN 组,实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blotting用于验证Nrf2在SFN诱导ugt1a中的作用。5.将细胞分为Control组、SFN及PD98059+SFN组。通过Western blotting实验技术检测各组细胞的Nrf2和ugt1a蛋白水平。通过活性氧检测试剂盒检测各组CRC 细胞中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。6.裸鼠皮下成瘤实验,给予不同浓度SFN,观察瘤体体积及质量变化。研究结果***抑制HT-29细胞及SW480细胞的增殖活性、细胞集落形成能力及细胞迁移能力,且具有浓度依赖性及时间依赖性(P1期,同时SFN的处理促进了细胞凋亡。(Pugt1a的表达(Pugt1a的表达,但在Nrf2 shRNA组中SFN的上调作用明显减弱(Pugt1a表达能力受到抑制,且诱导产生ROS的能力下降(Pugt1a的表达。***可能通过激活ERK通路促进Nrf2核内转位,诱导ugt1a的表达。

关键词：莱菔硫烷结直肠癌化学预防 ERK/Nrf2通路 ugt1a

蛋白激酶抑制剂对ugt1a及ugt1a3的影响

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蛋白激酶抑制剂对UGT1A及UGT1A3的影响

作者：肖永胜浙江大学

学位级别：硕士

目的探究蛋白激酶抑制剂姜黄素和钙感光蛋白C （calphostinC）对ugt1a及ugt1a3的影响。方法蛋白激酶抑制剂分别处理LS174T细胞和重组表达ugt1a3的Sf9细胞,通过Real-time PCR和Western blot分别检测处理前后的LS174T细胞内ugt1a和Sf... 详细信息

目的探究蛋白激酶抑制剂姜黄素和钙感光蛋白C （calphostinC）对ugt1a及ugt1a3的影响。方法蛋白激酶抑制剂分别处理LS174T细胞和重组表达ugt1a3的Sf9细胞,通过Real-time PCR和Western blot分别检测处理前后的LS174T细胞内ugt1a和Sf9细胞中ugt1a3表达量的变化;以木犀草素为底物进行体外孵育,检测处理前后LS74T细胞内ugt1a活性的变化和重组ugt1a3的活性变化;通过免疫沉淀和免疫印迹的方法观察蛋白激酶抑制剂处理前后重组ugt1a3磷酸化水平的变化。对ugt1a3预测的磷酸化位点进行定点突变并重组表达,比较野生型蛋白和突变型蛋白的代谢差异。结果在不引起细胞毒性和细胞形态变化的条件下,蛋白激酶抑制剂对LS174T细胞中ugt1a和Sf9细胞中重组ugt1a3的表达均无影响,但均可浓度依赖性抑制ugt1a和UG1A3的活性。体外孵育体系中添加姜黄素对木犀草素体外孵育具有抑制作用。进一步研究发现,经蛋白激酶抑制剂处理后,Sf9细胞内重组ugt1a3的磷酸化水平下降。突变体S43G催化三种黄酮类化合物的活性仅为野生型的58%-69%。结论姜黄素对ugt1a和ugt1a3具有直接抑制作用和间接抑制作用,而calphostin C只具有间接抑制作用。姜黄素对UGH A和ugt1a3的直接抑制作用很可能是其作为底物木犀草素的竞争性抑制剂引起的。姜黄素和calphostin C对ugt1a的间接抑制作用,很可能是通过抑制ugt1a的磷酸化修饰而介导的。ugt1a3在蛋白激酶C催化下可发生磷酸化修饰,且磷酸化修饰对ugt1a3活性具有调控作用。预测的ugt1a3磷酸化位点中,43位的丝氨酸很可能是其磷酸化位点。

关键词：姜黄素 calphostin C ugt1a ugt1a3 抑制磷酸化

Transgenic UDP-Glucuronosyltransferase 1 （Tg-ugt1） Mice are Protected from Obesity-Induced Type 2 Diabetes

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Transgenic UDP-Glucuronosyltransferase 1 （Tg-UGT1） Mice ar...

原发性肝细胞癌对CYP及ugt药物代谢酶的影响研究

第十五届国际药理学大会

作者： Bonzo Jessica Senekeo-Effenberger Kathy Tukey Robert University of California San Diego University of California San Diego University of California San Diego

＜正＞ Obesity - induced type 2 diabetes is a growing human health issue in Western societies . Fibrates used to treat diabetes are targeted by glucuronidation for elimination. To examine the contribution of human glucuronidation towards obesity - induced type 2 diabetes, wild type （WT） and Tg - ugt1 male mice were fed a normal diet or a 35% fat diet （HFD）. Mass gain was monitored and diabetic status established. HFD WT mice were insensitive to insulin, retained elevated blood glucose levels, and displayed hyperinsulinemia. HFD Tg - ugt1 mice were protected from these markers of type 2 diabetes. To determine if human ugtIA expression correlated with protection. ugtIA protein levels were measured by Western blot. ugtIA proteins in the small intestine were down- regulated in HFD Tg - ugt1 mice. Time course studies established the point of ugtIA protein reduction in relation to disease onset and disease protection. While it is not clear why down - regulation of the human ugtIA proteins might protect against type 2 diabetes, the reduction may increase the potential for toxicity of drugs in diabetic patients. Supported by USPHS grant GM49135

关键词： Transgenic mice ugt1a diabetes glucuronidation

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原发性肝细胞癌对CYP及UGT药物代谢酶的影响研究

作者：周娟南方医科大学

学位级别：硕士

原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于肺癌、胃癌而居第三位,其中男性发病率比女性高1.4-3.3倍。肝脏是体内以代谢功能为主的一个器官,体内的物质,包括摄入的食物... 详细信息

原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于肺癌、胃癌而居第三位,其中男性发病率比女性高1.4-3.3倍。肝脏是体内以代谢功能为主的一个器官,体内的物质,包括摄入的食物,药物等在肝脏内进行重要的生物转化:如氧化,还原,水解,结合等一系列化学反应,使物质的结构发生改变。这些过程均需要药物代谢酶的参与。药物治疗HCC(Hepatocellular carcinoma,原发性肝细胞癌)是近年来研究的热点,肝脏肿瘤状态下代谢酶的改变必然会影响药物在体内的代谢过程,从而导致药物疗效的降低和(或)导致肿瘤细胞对药物的敏感性下降以及药物蓄积中毒等。因此,评价HCC患者肝细胞内药物代谢酶的催化能力及其在肿瘤组织中的蛋白表达水平显得尤为重要。细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)与葡萄糖醛酸化转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,ugts)在众多药物代谢过程中起重要作用,对于HCC晚期的病人,特别是巨型肝癌且不适于手术的患者,肝癌细胞内CYP450与ugts的改变对药物在肝内的代谢具有重大影响。本论文选择5例HCC病例,研究大量表达于肝细胞内并起主要催化作用的Ⅰ相代谢酶CYP3A4以及Ⅱ相代谢酶中的主要家族ugt1a及其同工酶ugt1a1、ugt1a9在同一个体非肿瘤组织(定义为正常组织)与肿瘤组织中催化活性及酶表达量的差异。为研究HCC状态下代谢酶的活性变化,我们选取了 4个特异性化合物:内源性物质睾丸酮(testosterone),具有抗肿瘤活性的天然产物染料木素(genistein),临床一线抗肿瘤药物伊立替康(CPT-11)的活性代谢产物SN-38以及麻醉药异丙酚(propofol),他们分别为 CYP3A4,ugt1a,ugt1a1,ugt1a9 的特异性底物。采用体外药物代谢研究方法,考察同一个体中非肿瘤组织与肿瘤组织微粒体中代谢酶的酶动力学特征,从而评价肿瘤细胞中药物代谢酶催化能力的改变与差异。为进一步研究药物代谢酶在HCC组织中的差异及其催化能力发生改变的初步机理,我们采用蛋白免疫印记法(Westernblot),利用多克隆或单克隆抗体使之与酶蛋白特异性结合的特性,考察CYP3A4,ugt1a,ugt1a1,ugt1a9酶的蛋白表达量在肿瘤组织与非肿瘤组织中的变化与差异,初步阐明了肿瘤组织中药物代谢酶催化能力的变化与酶蛋白表达量呈正相关。一、研究方法与技术1.人肝微粒体(humanlivermicrosomes,HLM)的制备与蛋白测定经南方医院道德与伦理委员会批准,HCC患者外科手术后,取部分样本于冰冻生理盐水中,并于30 min内于冷库进行微粒体的制备。毗邻肝癌包膜外的组织人为定义为正常组织(部分有肝硬化结节),分离正常组织与肿瘤组织(弃包膜),采用差速离心法制得肝微粒体,正常组织所得微粒体(normalhumanliver microsomes,NHLM)为单个样本的正常对照组,肿瘤组织微粒体(tumorhuman livermicrosomes,THLM)为实验组。5例HCC病例(分别编号为1-5号)病理学检查为原发性肝细胞癌Ⅲ～Ⅳ期,即中低分化。2.人肝微粒体与睾丸酮的Ⅰ相代谢反应体系睾丸酮为体外探针药物,将5例NHLM和THLM分别按等蛋白量混合,以商业化正常人肝微粒体(pooled human liver microsomes,PHLM)作为参照,评价HCC病例所得NHLM与THLM的酶动力学特征与正常人肝微粒体的差异,按三组实验所得表观酶动力学参数Km的范围,选取高中低三个浓度(3Km,Km,1/5 Km)分别考察各个样本中NHLM和THLM对睾丸酮的代谢速率,以评价CYP3A4的酶活性。3.人肝微粒体与底物的Ⅱ相代谢反应体系以商业化正常人混合微粒体PHLM作为参照,分别考察三种底物(genistein,SN-38,propofol)在NHLM和THLM中的ugt酶动力学特征并得出酶动力学参数,以评价ugt1a、ugt1a1及ugt1a9的酶活性。4.酶动力学数据分析及统计学分析以形成代谢产物代谢速率与底物浓度的比值为横坐标,生成代谢产物代谢速率为纵坐标作Eadie-Hofstee图。根据Eadie-Hofstee图的情况判定为典型米氏方程模型或非典型动力学模型,采用ADAPT Ⅱ软件进行拟合,为了找出最合适的模型,采用阿开克(氏)信息判据(Akaike’s information criterion,AIC)对各个侯选模型进行判别,并应用简约性原则(the rule of parsimony)选择最佳模型,经软件拟合后得酶动力学参数。本文涉及代谢速率的比较均采用SPS

关键词：原发性肝细胞癌 CYP3A4 ugt1a 代谢能力酶蛋白表达

Polymorphisms of the UDP-glucuronosyl transferase 1A genes are associated with adverse events in cancer patients in Chinese receiving irinotecan-based chemotherapy

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Polymorphisms of the UDP-glucuronosyl transferase 1A genes a...

2015年（第五届）药物毒理学年会

作者： Sha liao Lixue Song Zhenqing Zhang Jingfeng Xu State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology Department of Pharmacy General Hospital of Beijing Military Command

Aim:A prodrug,irinotecan,is a semisynthetic derivative of *** inhibits topoisomerase I and is used as the first-line antitumor agent in cancer chemotherapy primarily for the treatment of solid tumors in ***-diphosphate glucuronosyl transferase 1A（ugt1a） is a key enzyme involved in irinotecan metabolism,and polymorphisms in the ugt1 A gene are associated with irinotecan-induced toxicity,such as diarrhea and *** aim of this study was to determine whether ugt1 A polymorphisms affect the severe irinotecan toxicity in Chinese patients with carcinoma of rectum,cervical carcinoma and epithelial ovarian ***:196 patients with tumor treated with irinotecan-based chemotherapy were *** association with toxicity was investigated by univariate and multivariate statistical *** risk factors of adverse reactions due to irinotecan were analyzed by Logistic regression *** results were represented by odds ratio（OR） and 95%confidence interval（CI）.The gene polymorphism of ugt1a1*6,ugt1a1*28,ugt1a3*1,ugt1a3*2,ugt1a3*3,ugt1a3*4,and ugt1a9*22 were detected by ***:The incidences of level Ⅱ-Ⅳ and Ⅲ-Ⅳ delayed diarrhea in ugt1a1*28 wild type（WW） carriers were significantly lower than those in the mutant heterozygote（WM）+homozygous mutant（MM） genotype carriers[Ⅱ-Ⅳ:p=0.006;Ⅲ-Ⅳ:P=0.001].The incidences of level Ⅱ-Ⅳdelayed diarrhea in ugt1a9*22（WW） carriers were significantly lower than those in the WM and MM carriers[26.2%vs.47.6%,P=0.006;26.2%vs.51.1%P=0.0057].There were no statistical differences in incidences of level III-IV neutropenia among the patients with different *** regression analysis showed that ugt1 A genotype was related to the delayed diarrhea（OR=5.657,95%CI 4.782-7.245,P=0.039）.Conclusion:ugt1a1*28 and ugt1a9*22 gene polymorphism may increase the risk of delayed diarrhea induced by irinotecan.A genetic-based algorithm to optimise treatment individualisation is proposed.

关键词： ugt1a Genetic polymorphism Irinotecan Delayed diarrhea Neutropenia

来源： cnki会议评论

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他汀类药物与其他药物的相互作用

中国医院药学杂志 2008年第4期28卷 298-301页

作者：温文冰成伙清刘治军广东众生药业股份有限公司广东东莞523325

目的:部分脂溶性他汀药物是CYP3A4/5的底物,其代谢易被其他药物所诱导或抑制,也可能抑制其他药物的代谢,本资料拟总结上述常见的相互作用,供临床用药参考。方法:检索Medline1966-2006年期间公开发表的他汀类与其他药物代谢方面的相互作... 详细信息

目的:部分脂溶性他汀药物是CYP3A4/5的底物,其代谢易被其他药物所诱导或抑制,也可能抑制其他药物的代谢,本资料拟总结上述常见的相互作用,供临床用药参考。方法:检索Medline1966-2006年期间公开发表的他汀类与其他药物代谢方面的相互作用文献,进行分析、归纳。结果:他汀类药物与临床经常合用的其他药物包括口服抗凝药、抗感染药物、其他调血脂药物、抗HIV药物等存在临床意义的相互作用。结论:临床对于他汀类药物与其他药物联合应用时应该谨慎,注意避免或减少不良相互作用,保障用药安全有效。

关键词：他汀类药物CYP3A4 OATP ugt1a 肌病药物相互作用

尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1家族肽A基因多态性与伊立替康所致不良反应的相关性研究

维普期刊数据库

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药物不良反应杂志 2013年第3期15卷 136-140页

作者：宋丽雪王金萍高昕许卫东北京军区总医院药理科 100700 北京军区总医院附属八一脑科医院VIP病房

目的探讨尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1家族肽A（ugt1a）基因多态性与抗肿瘤药伊立替康所致不良反应的相关性，为肿瘤患者个体化用药提供参考。方法研究对象为233名健康志愿者和196例应用伊立替康治疗的肿瘤患者。健康志愿者中男性169名... 详细信息

目的探讨尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1家族肽A（ugt1a）基因多态性与抗肿瘤药伊立替康所致不良反应的相关性，为肿瘤患者个体化用药提供参考。方法研究对象为233名健康志愿者和196例应用伊立替康治疗的肿瘤患者。健康志愿者中男性169名，女性64名；平均年龄（25±5）岁。肿瘤患者中肠癌92例，宫颈癌45例，卵巢上皮细胞癌 59例；男性54例，女性142例；平均年龄（61±19）岁。采用焦磷酸测序法对2组受试者进行ugt1a1＊6、ugt1a1＊28、ugt1a3＊1、ugt1a3＊2、ugt1a3＊3、ugt1a3＊4 和ugt1a9＊22基因多态性检测，比较2组受试者ugt1a基因型突变频率，比较不同ugt1a基因型患者迟发性腹泻和白细胞和/或中性粒细胞减少发生率，采用Logistic 回归方法分析伊立替康致不良反应的危险因素，结果以相对危险度（OR）及95%置信区间表示。结果肿瘤患者ugt1a3＊2基因型突变频率明显低于健康志愿者（50.3%比68.5%，P=0.014），而ugt1a3＊3基因型突变频率明显高于健康志愿者（26.0%比6.2%， P=0.001）。196例肿瘤患者Ⅱ～Ⅳ度迟发性腹泻发生率为48.5%（95例），Ⅲ～Ⅳ度迟发性腹泻发生率为11.2%（22例）；Ⅲ～Ⅳ度中性粒细胞减少发生率为49.0%（96例）。ugt1a1＊28位点野生型纯合子（WW）基因型携带者Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度迟发性腹泻发生率均明显低于突变型杂合子（WM）＋突变型纯合子（MM）基因型携带者［Ⅱ～Ⅳ度：40.4%（57/141）比69.1%（38/55），P=0.006；Ⅲ～Ⅳ度：5.7%（8/141）比25.5%（14/55），P=0.001］；ugt1a9＊22位点WW基因型携带者Ⅱ～Ⅳ度迟发型腹泻发生率明显低于WM＋MM基因型携带者［26.2%（17/65）比47.6%（40/84），P=0.006；26.2%（17/65）比51.1%（24/47）, P=0.0057］，未发现不同基因型患者之间Ⅲ～Ⅳ度中性粒细胞减少发生率差异存在统计学意义。Logistic回归分析显示ugt1a基因型与迟发性腹泻的发生相关（OR=5.657，95%置信区间为4.782～7.245，P=0.039）。结论ugt1a1＊ 28 和ugt1a9＊ 22基因多态性可增加伊立替康所致迟发性腹泻的风险。

关键词： ugt1a 基因突变伊立替康迟发性腹泻白细胞和(或)粒细胞减少