蛋白激酶抑制剂对UGT1A及UGT1A3的影响

作     者：肖永胜 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾苏

授予年度：2013年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100704[医学-药物分析学] 10[医学] 

主      题：姜黄素 calphostin C UGT1A UGT1A3 抑制 磷酸化 

摘      要：目的探究蛋白激酶抑制剂姜黄素和钙感光蛋白C （calphostinC）对UGT1A及UGT1A3的影响。 方法蛋白激酶抑制剂分别处理LS174T细胞和重组表达UGT1A3的Sf9细胞,通过Real-time PCR和Western blot分别检测处理前后的LS174T细胞内UGT1A和Sf9细胞中UGT1A3表达量的变化;以木犀草素为底物进行体外孵育,检测处理前后LS74T细胞内UGT1A活性的变化和重组UGT1A3的活性变化;通过免疫沉淀和免疫印迹的方法观察蛋白激酶抑制剂处理前后重组UGT1A3磷酸化水平的变化。对UGT1A3预测的磷酸化位点进行定点突变并重组表达,比较野生型蛋白和突变型蛋白的代谢差异。 结果在不引起细胞毒性和细胞形态变化的条件下,蛋白激酶抑制剂对LS174T细胞中UGT1A和Sf9细胞中重组UGT1A3的表达均无影响,但均可浓度依赖性抑制UGT1A和UG1A3的活性。体外孵育体系中添加姜黄素对木犀草素体外孵育具有抑制作用。进一步研究发现,经蛋白激酶抑制剂处理后,Sf9细胞内重组UGT1A3的磷酸化水平下降。突变体S43G催化三种黄酮类化合物的活性仅为野生型的58%-69%。 结论姜黄素对UGT1A和UGT1A3具有直接抑制作用和间接抑制作用,而calphostin C只具有间接抑制作用。姜黄素对UGH A和UGT1A3的直接抑制作用很可能是其作为底物木犀草素的竞争性抑制剂引起的。姜黄素和calphostin C对UGT1A的间接抑制作用,很可能是通过抑制UGT1A的磷酸化修饰而介导的。UGT1A3在蛋白激酶C催化下可发生磷酸化修饰,且磷酸化修饰对UGT1A3活性具有调控作用。预测的UGT1A3磷酸化位点中,43位的丝氨酸很可能是其磷酸化位点。