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甘蔗ugpase5'侧翼序列克隆及缺失表达分析

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植物研究 2014年第1期34卷 62-67页

作者：叶冰莹王婷何文锦邱思陈由强福建师范大学生命科学学院福州350108 农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室福州350108 发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室福州350108

以甘蔗(FN95;-1702)为材料,通过接头连接PCR方法克隆该基因不同长度5'侧翼序列。将不同长度的5'侧翼序列连同ugpase基因的外显子片段定向插入到GUS基因上游,在保证其后GUS编码框不发生偏移的情况下,插入的ugpase外显子融合GUS表达成为... 详细信息

以甘蔗(FN95;-1702)为材料,通过接头连接PCR方法克隆该基因不同长度5'侧翼序列。将不同长度的5'侧翼序列连同ugpase基因的外显子片段定向插入到GUS基因上游,在保证其后GUS编码框不发生偏移的情况下,插入的ugpase外显子融合GUS表达成为新的报告基因。根据此策略,构建了一系列表达结构为5'Flanking Sequence-ugpase Exon-GUS-Nos polyA的5'侧翼序列缺失表达载体,进行启动子活性分析。注射法转染烟草叶片组织检测GUS瞬时表达,分析结果表明,所克隆到的ugpase基因5'端侧翼序列不具有启动子活性。

关键词： 5’侧翼序列缺失表达甘蔗 ugpase

Amplification of ugpase cDNA 3＇ UTR from Saccharum Officinarum

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Journal of Life Sciences 2010年第1期4卷 43-45页

作者： Bingying Ye Ling Lian Youqiang Chen Rukai Chen College of Life Sciences Fujian Normal University Fuzhou 350108 China Key Laboratory of Sugarcane Genetics and Breeding Ministry of Agriculture Fuzhou 350108 China Rice Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences Fuzhou 350019 China

UDP-glucose pyrophosphorylase is an important enzyme concerned with carbohydrate metabolism in plants. Cloning of ugpase is a premise for further study on molecular level, and it is also crucial for study of carbohydrate metabolism. ugpase cDNA sequence as a template, designed primer, then 3＇-untranslate region （3＇ UTR） of ugpase were amplified by 3＇-rapid amplification of cDNA ends （3＇-RACE）. The results suggested the 3＇ UTR were 243 bp, contained AATAA sequence and Poly（A）.

关键词： ugpase rapid amplification of cDNA ends (RACE) amplification of 3' UTR sequence analysis.

转ugpase基因喜树木材化学成分与生长速率研究(英文)

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植物研究 2007年第5期27卷 612-615页

作者：于景华李艳华张学科祖元刚唐中华常影高银祥东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室哈尔滨150040

分析了田间栽培条件下2年生转ugpase基因喜树与对照株的木材化学成分与生长速率。结果表明,转ugpase基因喜树综纤维素含量达到78.87%,比对照株相比提高了2.23%;纤维素含量为36.34%,与对照株相比没有明显提高;木质素含量为15.05%,较对照... 详细信息

分析了田间栽培条件下2年生转ugpase基因喜树与对照株的木材化学成分与生长速率。结果表明,转ugpase基因喜树综纤维素含量达到78.87%,比对照株相比提高了2.23%;纤维素含量为36.34%,与对照株相比没有明显提高;木质素含量为15.05%,较对照株降低了1.75%;两者的灰分含量均较低且无显著差异;冷、热水抽提物含量为7.62%与10.17%,分别提高了2.04%与2.13%;1%NaOH抽提物含量为27.13%,提高了1.27%。因此,就综纤维素、木质素、灰分含量而言,转ugpase基因喜树为优质纸浆材,水抽提物和1%NaOH抽提物的含量略高,在纸浆生产中需加以重视。本文还对转ugpase基因喜树与对照株的株高、基径、生物量进行了动态监测,结果表明,从5月25日到11月10日的生长季中,其株高平均增加121 cm,对照株平均仅67.8 cm,株高生长速率提高了78.47%;基径平均增加1.792 cm,对照株平均仅0.532 8 cm,提高了236.37%;地上部分生物量的积累与对照相比提高了322.61%,即转入ugpase基因使喜树生长速率显著提高。因此,虽然转ugpase基因喜树的综纤维素和纤维素含量没有明显提高,但其生长速率快,生物量增长显著,间接提高了纤维素与喜树碱的产量。因此,转基因喜树较普通喜树更符合纸浆材速生、纤维素含量高和产量高、木质素含量低的基本要求,可在生产中进一步推广。

关键词：转基因喜树 ugpase 木材化学成分生长速率

Construction and Expression of Sugarcane ugpase cDNA Prokaryotic Expression Vector

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Journal of Life Sciences 2011年第12期5卷 981-985页

作者： Ling Lian Jianfu Zhang Bingying Ye Youqiang Chen Rukai Chen Key Laboratory of Hybrid Rice Germplasm Innovation and Molecular Breeding of South China Ministry of Agriculture P.R.China/FuzhouBranch National Rice Improvement Center of China/Fujian Engineering Laboratory of Crop Molecular Breeding/Fujian KeyLaboratory of Rice Molecular Breeding~Rice Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences Fuzhou 350003 China College of Life Sciences Fujian Normal University Fuzhou 350108 China Key Laboratory of Sugarcane Genetics and Breeding Ministry of Agriculture Fuzhou 350108 China

ugpase （UDP-glucose pyrophosphorylase）, one of the primary enzymes concerned with carbohydrate metabolism, catalyzes the formation of UDPG. By inserting the ugpase cDNA fragment cloned from Saccharum officinarum into PQE-30, the prokaryotic expression vector of PQE-UGP was successfully constructed. Then the vector plasmid of PQE-UGP was transformed into host bacteria M 15 and the expression of target gene was induced by Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside （IPTG）. The research laid foundation for study on the prokaryotic expression of ugpase.

关键词： ugpase construction of prokaryotic expression vector induced expression.

蔗糖、光照和温度对甘蔗ugpase调控影响的研究

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福建师范大学学报（自然科学版） 2013年第6期29卷 120-124,130页

作者：叶冰莹叶世超薛婷何文锦邱思陈由强福建师范大学生命科学学院福建发育与神经生物学重点实验室农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室福建福州350117

ugpase(UDP-glucose pyrophosphorylase,尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)是糖代谢过程中的关键酶,对蔗糖积累和细胞壁形成有重要影响.将处于生长期的甘蔗叶片经蔗糖、光照、冷诱导等条件处理后,测定ugpase酶活性,并利用real-time PCR技术... 详细信息

ugpase(UDP-glucose pyrophosphorylase,尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)是糖代谢过程中的关键酶,对蔗糖积累和细胞壁形成有重要影响.将处于生长期的甘蔗叶片经蔗糖、光照、冷诱导等条件处理后,测定ugpase酶活性,并利用real-time PCR技术同步测定Ugp的相对表达量.研究结果表明:环境中的蔗糖、低温(4℃)、光照对ugpase基因的表达调控呈上调,对ugpase酶活性有提高的作用.

关键词：甘蔗 ugpase 实时荧光定量PCR

甘蔗ugpase cDNA的克隆及序列分析

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福建师范大学学报（自然科学版） 2009年第3期25卷 105-108页

作者：连玲叶冰莹何炜张积森何文锦陈由强陈如凯福建师范大学生命科学学院福建福州350108 农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室福建福州350108 发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室福建福州350108

以甘蔗(FN95-1702)为材料,通过RT-PCR,首次克隆得到了甘蔗ugpase cDNA片段.该片段长1 495 bp,其中包含完整的ORF为1 431 bp,共编码476个氨基酸,并含有5个重要的Lys残基位点,分别为Lys257、Lys321、Lys367、Lys408、Lys409,它们对维持UGP... 详细信息

以甘蔗(FN95-1702)为材料,通过RT-PCR,首次克隆得到了甘蔗ugpase cDNA片段.该片段长1 495 bp,其中包含完整的ORF为1 431 bp,共编码476个氨基酸,并含有5个重要的Lys残基位点,分别为Lys257、Lys321、Lys367、Lys408、Lys409,它们对维持ugpase活性及与底物结合方面发挥着重要作用.

关键词： ugpase 基因克隆序列分析

铁皮石斛ugpase基因克隆表达分析及部分MYB基因家族分子克隆与温度胁迫分析

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铁皮石斛UGPase基因克隆表达分析及部分MYB基因家族分子克隆与温...

作者：吕楠西南交通大学

学位级别：硕士

ugpase是植物生长和糖分代谢通路的重要激酶之一,对铁皮石斛的生长和糖分的累积起着至关重要的作用。MYB转录因子家族是植物中最重要的基因家族之一,其中许多成员与植物的抗逆性有着紧密的关系。所以本次实验从这两个面着手研究。首先利... 详细信息

ugpase是植物生长和糖分代谢通路的重要激酶之一,对铁皮石斛的生长和糖分的累积起着至关重要的作用。MYB转录因子家族是植物中最重要的基因家族之一,其中许多成员与植物的抗逆性有着紧密的关系。所以本次实验从这两个面着手研究。首先利用RACE技术克隆得到铁皮石斛ugpase1的全长为3054bp的基因序列,其中开放阅读框长度为1530bp,一共编码了510个氨基酸,预测其编码的蛋白质序列分子量为51.7 kDa,性质为其为亲水性蛋白。对ugpase1基因发育进化树分析发现,ugpase1蛋白仅与油棕和波斯枣有一定的同源性。利用在线软件Expasy和SWISS-MODEL对其蛋白结构进行预测分析。随后利用实时荧光定量PCR技术分析ugpase1在铁皮石斛不同组织,不同生长年龄中的表达量。分析发现,在根茎叶三者相比较的时,根和茎中的表达量远远高于叶片中的表达量。在不同年份石斛材料分析时发现,1年和3年的材料中ugpase1基因整体表达高于6年等重要信息。通过阅读对比分析铁皮石斛多糖累积的文献,发现ugpase1基因的含量可能与糖分累积过程的活跃度和生长状态成正比例。其次一共得到克隆MYB转录因子家族中的12条序列,长度范围在983-2320bp,编码氨基酸范围203-410个之间,对其进行亚细胞预测分析。对已得到的序列建立进化树分析,利用MEME软件分析其氨基酸序列之间的相似性和预测序列的保守结构域。选出一个R1型MYB转录因子DoMYB04,进行蛋白质结构预测分析,之后在利用荧光定量PCR分析该基因在冷热温度胁迫下表达量的变化。实验发现DoMYB04基因表达量与温度的变化存在明显关系。所以推测在温度胁迫中,铁皮石斛植株能够保持正常的生理状态,有可能与DoMYB04基因表达量的变化有关。

关键词： ugpase MYB 铁皮石斛多糖温度胁迫实时荧光定量PCR

杨树C4H基因RNAi载体和ugpase基因过量表达载体的构建及其遗传转化研究

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杨树C4H基因RNAi载体和UGPase基因过量表达载体的构建及其遗传转...

作者：王方明安徽农业大学

学位级别：硕士

木质素是维管植物次生细胞壁的主要成分，长期以来由于其降低牧草饲用品质，影响纸张和纤维生物质能源的生产而备受关注。木质素的数量和其反应活性一直是困扰纸浆生产的两个重要的障碍。经过近20年来对苯丙氨酸代谢调控途径的研究，目... 详细信息

木质素是维管植物次生细胞壁的主要成分，长期以来由于其降低牧草饲用品质，影响纸张和纤维生物质能源的生产而备受关注。木质素的数量和其反应活性一直是困扰纸浆生产的两个重要的障碍。经过近20年来对苯丙氨酸代谢调控途径的研究，目前木质素合成代谢过程中关键酶的研究比较清晰。肉桂酸4-羟基化酶（C4H）是一类催化香豆酸4’位置的羟基化并且依赖于NADPH的细胞色素P450单氧酶。RNAi技术是一种有效的在转录水平上降低目的基因表达的技术。本研究中，构建C4H基因RNAi载体，通过转基因技术抑制杨树细胞内C4H基因的表达，获得低木质素含量的杨树转基因植株。纤维素微纤丝参与到植物细胞壁的合成，也是制浆过程中所需要的成分。有关纤维素的合成了解的很少，相比较“酶促反应”，科学家更倾向于认为纤维素合成过程是“细胞生理反应过程”。目前有关纤维素合成的研究主要集中在纤维素合成酶（CesA）和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶（ugpase）。有研究证明，过量表达ugpase基因可以显著增加植株的生物量和纤维素的含量。本研究中，通过构建ugpase过量表达载体，利用转基因技术提高细胞中ugpase的含量，获得高纤维素含量的杨树转基因植株。分别以南林95杨和南抗杨作为材料，构建了肉桂酸4-羟化酶RNAi载体pBI121+2F和尿苷二磷酸葡糖糖焦磷酸酶过量表达载体pBI121+ugpase。开展了农杆菌介导的遗传转化，并对转基因植株进行PCR检测。获得的主要结果如下：（1）利用RT-PCR技术从南林95杨中克隆到432bp大小的C4H基因片段，并成功构建了C4H基因的RNAi载体。从南抗杨中克隆到杨树全长的ugpase基因序列，全长共1410个碱基，编码469个氨基酸，成功构建ugpase基因的过量表达载体。（2）通过生物信息学分析，ugpase预测的分子量为51.64KD，等电点为5.56。EST表达分析显示该基因主要在花器官或其他顶端生长点组织表达。Pfam软件分析结果显示该酶具有一个明显的UDPGP结构域，运用3D-JIGSAW软件预测该酶的空间结构。ugpase家族进化分析显示，双子叶植物中该家族的保守性较单子叶植物低。（3）运用成功构建的ugpase过量表达载体进行农杆菌介导的杨树遗传转化，最终获得7株抗性苗，PCR初步确认其中有5株是转ugpase基因植株。综上所述，本研究成功从杨树中克隆C4H基因的部分序列和ugpase基因的全长序列，成功构建了C4H基因的RNAi载体。运用多种生物信息学软件，对ugpase基因进行比对、结构预测和进化树分析。成功获得5株过量表达ugpase基因的转基因苗，为进一步研究木质素和纤维素合成代谢奠定基础。

关键词：杨树 RNAi C4H ugpase 过量表达

香菇种质资源多样性及培养条件对其ugpase、Laccase的影响

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香菇种质资源多样性及培养条件对其UGPase、Laccase的影响

作者：陈小敏四川农业大学

学位级别：硕士

中国香菇种质资源丰富,生产规模较大,但在生产中却存在着品质较差、菌种退化、专用加工品种缺乏的问题。多糖作为香菇主要活性成分,对其分子调控机理研究尚处于起步阶段。研究香菇种质资源多样性是菌株选育和新品种开发的前提和基础。... 详细信息

中国香菇种质资源丰富,生产规模较大,但在生产中却存在着品质较差、菌种退化、专用加工品种缺乏的问题。多糖作为香菇主要活性成分,对其分子调控机理研究尚处于起步阶段。研究香菇种质资源多样性是菌株选育和新品种开发的前提和基础。本研究从全国各地广泛收集香菇推广菌株53份、野生资源22份,共计75份。通过田间栽培试验观测不同香菇菌株的表型性状,利用ITS、ISSR技术分析菌株的遗传多样性,通过化学分析测定菌株在菌丝阶段和子实体阶段的多糖含量,并评价了不同碳氮源和温度对香菇尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ugpase)、漆酶(Laccase)酶活及其调控基因转录表达特征的影响,为进一步选育优质加工型香菇品种和优化香菇栽培提供理论依据。主要结果如下:(1)生长速度测定结果显示菌株52(725)的菌丝生长速度最快(0.82 cm/d),其次是菌株51(江西香菇)。田间栽培试验显示:受高温天气的影响崇州基地出菇情况较差,多为畸形菇。泸定温度适宜,更适合香菇的生长,出菇情况较好,菇形圆整厚实。整体上看,引进资源出菇情况优于野生菌株,引进资源子实体农艺性状较好,而野生菌株抗逆性、抗污染率高、出菇情况差、子实体外型均表现较差。(2)香菇菌株在菌丝体和子实体阶段多糖含量存在明显的差异。12个菌株的菌丝体多糖含量高于4.0%,其中野生菌株74(冕宁浅灰)菌丝体含量最高(6.0%),其次是引进资源45(931-9)(5.8%)。4个菌株的子实体多糖含量高于4%,其中菌株3(广香2044)的子实体含量最高(5.3%),其次是菌株26(苏选615)(4.3%),野生资源的子实体多糖含量明显低于引进资源菌丝体多糖含量。(3)系统发育分析显示:75株香菇菌株表现出明显的遗传多样性,基于ITS序列构建的系统发育树中菌株57(LDT11-77)和60(LDT2011.2)相似度达到99%。供试菌株在在0.62的相似水平上聚为一类;在0.74的水平上,供试菌株大致分为6类。(4)不同碳氮源对香菇菌丝体胞内多糖含量、ugpase酶活及其调控基因相对表达量的影响研究结果表明:香菇菌丝UGP基因表达量、ugpase酶活以及菌丝胞内多糖间存在明显的正相关关系。以小分子糖(蔗糖、麦芽糖和甘露糖)为碳源、有机复合物(麦麸和黄豆芽)为氮源时,UGP基因的相对表达量明显上调,ugpase酶活性更高,菌丝胞内多糖含量也明显提高。其中蔗糖和麦麸处理下的UGP基因表达量、ugpase酶活性和菌丝胞内多糖含量最高。小分子碳源(蔗糖、麦芽糖和甘露糖)、有机氮源(麦麸和黄豆芽)有助于香菇菌丝多糖的合成,可作为香菇菌丝液体发酵优势碳源和氮源。(5)不同温度(20 C、25 C、28 C和30 C)培养条件下,香菇漆酶活性及其基因表达调控特征研究结果表明:25 C培养条件下香菇菌丝圈及氧化圈最大,而30 C时的菌丝圈和氧化圈最小。最高漆酶活性最低漆酶活性分别出现在25 C和30 C培养条件下。不同温度胁迫下漆酶同工酶基因存在差异性表达,以25 C为对照组,20 C培养条件下9个漆酶基因(Llac1-3、Llac5和Llac7-11)表达量上调,28 C胁迫下除Llac5和Llac7基因以外,其余8个漆酶基因表达量发生上调,而30 C处理组6个漆酶基因(Llac1-2、Llac4、Llac7-8和Llac10)表达量下调。不同温度胁迫下香菇漆酶活性及其基因出现差异性表达,研究结果对于进一步揭示香菇漆酶的分子调控机制,优化香菇栽培具有重要意义。

关键词：香菇粗多糖农艺性状遗传多样性 ugpase Laccase 实时荧光定量PCR