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taqman探针实时荧光PCR方法检测粪便中微小隐孢子虫卵囊

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第4期30卷 333-334,F0003页

作者：邵景东吴琳吴福平傅春玲王毅谦范丽丽张家港出入境检验检疫局张家港215600 苏州大学医学部公共卫生学院苏州215123

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果... 详细信息

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果显示,该方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增,其他常见的肠道原虫和肠道病原菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊基因组DNA检测的灵敏度为26个/ml;对加标粪样可检测至2 600个/ml卵囊。提示本研究建立的实时荧光PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法具有快速、特异性和敏感性高等优点。

关键词：微小隐孢子虫 taqman探针实时荧光PCR 检测

taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

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现代食品科技 2018年第3期34卷 191-195,202页

作者：游淑珠唐食明蔡教英姚丽锋王小玉冯家望丁琦符家忍珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心广东珠海519000

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145... 详细信息

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d^7 d缩短为仅需2 h^3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。

关键词：大肠埃希氏菌 O145血清型 taqman探针荧光PCR 食品检测

taqman探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

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植物保护 2024年第2期50卷 219-227,239页

作者：孙爱青王丽花张艺萍杨秀梅许凤苏艳云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室国家观赏园艺工程技术研究中心昆明650205 云南大学昆明650091

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标... 详细信息

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于taqman探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒 taqman探针 RT-qPCR 兰花

taqman探针用于转基因食品的荧光定量PCR检测

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食品与发酵工业 2003年第12期29卷 1-7页

作者：蔡慧农刘光明苏文金王璋集美大学生物工程学院厦门361021 厦门出入境检验检疫局厦门361012 中国食品发酵工业研究院北京100027

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的taqman探针 ,确定了探针浓度和镁... 详细信息

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的taqman探针 ,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件 ,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增 ,在PCR反应过程中分别以TET和FAM两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化 ,并依此绘制了ΔCt值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线 ,建立了转基因大豆和转基因玉米的taqman -荧光定量PCR检测方法 ,该方法具有探针设计较简便、成本较低的特点 ,初步实现了对转基因食品的定量分析及品种鉴定。

关键词： taqman探针转基因食品荧光定量PCR检测安全性评价

taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分

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食品与生物技术学报 2015年第10期34卷 1083-1088页

作者：陈轩廖秀云陶旻罗宝正薄清如沙才华黄海超徐海聂杨素珠海出入境检验检疫局国家外来病检测重点实验室广东珠海519015

针对鲨鱼产品掺杂造假增多而缺乏有效鉴定技术的情况,作者根据Gen Bank中鲨鱼基因的线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Primer Express 2.0设计了一套特异性引物和探针,用来建立taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分的方法。结果表... 详细信息

针对鲨鱼产品掺杂造假增多而缺乏有效鉴定技术的情况,作者根据Gen Bank中鲨鱼基因的线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Primer Express 2.0设计了一套特异性引物和探针,用来建立taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分的方法。结果表明,对13份已鉴定为鲨鱼鱼翅的样品进行检测,全部出现特异性扩增曲线,阴性对照没有荧光增长。方法特异性强,对市场购买的12份鲨鱼源性样品及9份其他鱼类样品进行检测,12份鲨鱼样品均出现荧光扩增曲线,而非鲨鱼样品均未出现荧光增长;方法灵敏度较高,可检测到的最低质粒拷贝数量级为10拷贝/μL;方法快速准确,操作简便,重复性好,稳定可靠,可应用于市场上鱼翅等常见鲨鱼源性产品的真假鉴定。

关键词：鲨鱼源性成分 taqman探针荧光PCR 检测

taqman探针熔解曲线技术检测GJB2基因突变

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中华耳科学杂志 2015年第3期13卷 541-544页

作者：高慧刘晶晶沈姗姗梁少明危林耿李芳芳王沙燕暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院深圳518020 亚能生物技术(深圳)有限公司深圳518133

目的建立快速可靠的Taq Man探针熔解曲线技术,分析非综合征型遗传性耳聋患者的GJB2基因及探讨Taq Man探针熔解曲线技术。方法制备标准品,利用Taq Man探针基于荧光PCR熔解曲线平台建立熔解曲线分析技术;收集138例正常人群、113例非综合... 详细信息

目的建立快速可靠的Taq Man探针熔解曲线技术,分析非综合征型遗传性耳聋患者的GJB2基因及探讨Taq Man探针熔解曲线技术。方法制备标准品,利用Taq Man探针基于荧光PCR熔解曲线平台建立熔解曲线分析技术;收集138例正常人群、113例非综合征型遗传性耳聋患者及2个非综合征型遗传性耳聋家系,应用Taq Man探针熔解曲线技术分析GJB2基因最常见的35del G,176_191del16,235del C,299_300del AT的4个突变位点;结果利用直接测序技术加以验证。结果 138例正常人群中检出2例GJB2基因突变,113例非综合征型遗传性耳聋患者中检出22例GJB2基因突变,2个耳聋家系先证者均为GJB2基因突变患者;所有检测结果均与测序结果一致。结论利用Taq Man探针建立了一种快速可靠的探针熔解曲线技术,经测序验证能准确的检测GJB2基因常见的4种突变。

关键词：遗传性耳聋 taqman探针熔解曲线 GJB2基因

taqman探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

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中国人兽共患病学报 2012年第6期28卷 602-606页

作者：赵素慧王春晖周莹韦耀韩桂圆钮红岺赵卫张其威万成松南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515

目的建立taqman探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及taqman探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制... 详细信息

目的建立taqman探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及taqman探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了taqman探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因taqman探针实时荧光定量PCR新方法。

关键词：土拉弗朗西斯菌 taqman探针 fopA基因荧光定量PCR

taqman探针实时荧光定量PCR检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平及其临床意义

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中国病理生理杂志 2013年第2期29卷 348-353页

作者：吴瑞珊苏运钦余广超林晓丹李莉陈文璟温旺荣暨南大学附属第一医院临床医学检验中心广东广州510632

目的:运用taqman探针实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平并探讨其临床意义。方法:设计miR-122及U6 snRNA的茎环引物和taqman探针,运用taqman探针实时荧光定量PCR检测27例肝癌术前(HCC)患者、15例... 详细信息

目的:运用taqman探针实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平并探讨其临床意义。方法:设计miR-122及U6 snRNA的茎环引物和taqman探针,运用taqman探针实时荧光定量PCR检测27例肝癌术前(HCC)患者、15例乙型肝炎(hepatitis B)患者、15例丙型肝炎(hepatitis C)患者、15例正常对照者(HC)、11例肝癌术后(PHCC)患者及10例肝癌术后复发(recurrence)患者血清中miR-122的表达水平,并分析miR-122与肝脏疾病相关标志物的关系。结果:taqman探针实时荧光定量PCR方法能检测血清中miR-122的表达。HCC、hepatitis B、hepatitis C及recurrence患者血清中miR-122的表达水平均高于HC和PH-CC患者(P0.05),PHCC患者血清miR-122的表达水平比HCC和recurrence患者低(Ptaqman探针实时荧光定量PCR适用于检测血清miR-122的表达水平。在HCC、hepatitis B、hepatitisC及recurrence患者血清中miR-22均有不同程度的增高,尤其是hepatitis C患者,且PHCC患者血清miR-122表达下降,复发后升高。血清miR-122的表达与肝脏疾病的某些指标有关,提示血清miR-122可作为肝脏疾病,特别是肝癌早期诊断、手术疗效及预后判断的新指标。

关键词： taqman探针实时荧光定量PCR miR-122 肝细胞癌

taqman探针实时荧光PCR快速检测苹果牛眼果腐病菌方法的建立

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植物检疫 2016年第2期30卷 55-62页

作者：林惠娇王卫芳易建平胡学难何日荣蒋湘黄埔出入境检验检疫局广东广州510730 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室上海出入境检验检疫局

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malicorticis、***、***和***)是我国检疫性植物病原真菌,为建立该病菌的实时荧光PCR检测法,根据病菌及其近缘种的翻译延伸因子(EF-1α)的保守序列设计了特异性探针,分别以苹果牛眼果腐病菌菌株和本研究构... 详细信息

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malicorticis、***、***和***)是我国检疫性植物病原真菌,为建立该病菌的实时荧光PCR检测法,根据病菌及其近缘种的翻译延伸因子(EF-1α)的保守序列设计了特异性探针,分别以苹果牛眼果腐病菌菌株和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。结果显示探针MAL-P、PER-P、ALB-P和KIE-P分别对***、***、***和***表现特异性阳性扩增,而与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,单重探针和4种探针混合液的灵敏度分别达1 fg/μL和10 fg/μL DNA。总计从美国、智利、新西兰、法国进境截获的29批可疑病果的分离物中检测到PCR阳性荧光信号,包括20批***、8批***和1批***。该方法在6 h内即可完成整个检测流程,其特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中苹果牛眼果腐病菌的快速检测。

关键词：苹果牛眼果腐病菌 Neofabraea属快速检测 taqman探针实时荧光PCR