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A Bama miniature pig model of monoallelic tsc1 mutation for human tuberous sclerosis complex

Journal of Genetics and Genomics 2020年第12期47卷 735-742页

作者： Xiaoxue Li Tingdong Hu Jiying Liu Bin Fang Xue Geng Qiang Xiong Lining Zhang Yong Jin Xiaorui Liu Lin Li Ying Wang Rongfeng Li Xiaochun Bai Haiyuan Yang Yifan Dai Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation Nanjing Medical UniversityNanjing 211166China Key Laboratory of Targeted Intervention of Cardiovascular Disease Collaborative Innovation Center for Cardiovascular Disease Translational MedicineNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Cell Biology Guangdong Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Degenerative DiseasesSchool of Basic Medical SciencesSouthern Medical UniversityGuangzhou 510515China State Key Laboratory of Reproductive Medicine Nanjing Medical UniversityNanjing 211166China Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center Institute of Translational MedicineShenzhen Second People's HospitalFirst Affiliated Hospital of Shenzhen UniversityShenzhen 518035China

Tuberous sclerosis complex(tsc)is a dominant genetic neurocutaneous syndrome characterized by multiple organ *** rodent models bearing a germline mutation in either tsc1 or tsc2 gene have been generated,they do not develop pathogenic lesions matching those seen in patients with tsc because of the significant differences between mice and humans,highlighting the need for an improved large animal model of ***,we successfully generate monoallelic tsc1-modified Bama miniature pigs using the CRISPR/Cas9 system along with somatic cell nuclear transfer(SCNT)*** expression of phosphorylated target ribosomal protein S6 is significantly enhanced in the piglets,indicating that disruption of a tsc1 allele activate the mechanistic target of rapamycin(mTOR)signaling ***,differing from the mouse tsc models reported previously,the tsc1^(+/−)Bama miniature pig developed cardiac rhabdomyoma and subependymal nodules,resembling the major clinical features that occur in patients with *** tsc1^(+/−)Bama miniature pigs could serve as valuable large animal models for further elucidation of the pathogenesis of tsc and the development of therapeutic strategies for tsc disease.

关键词： CRISPR/Cas9 Cardiac rhabdomyosarcoma Subependymal nodules tsc1 Tuberous sclerosis complex

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小檗碱调控AMPK-tsc1/LC3-Ⅱ信号通路促进高糖高脂应激下NIT-1胰岛β细胞的自噬

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中国医院药学杂志 2020年第1期40卷 29-37页

作者：胡亚耘陆付耳胡倩易屏华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所湖北武汉430030 武汉市中西医结合医院内分泌科湖北武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科湖北武汉430030

目的:观察小檗碱(berberine, BBR)对高糖高脂应激条件下的NIT-1胰岛β细胞自噬的影响并探讨其潜在的分子机制。方法:分别采用高浓度葡萄糖(25 mmol·L^-1)和软脂酸(0.25 mmol·L^-1)诱导NIT-1胰岛β细胞建立高糖、高脂模型,予以小檗碱处... 详细信息

目的:观察小檗碱(berberine, BBR)对高糖高脂应激条件下的NIT-1胰岛β细胞自噬的影响并探讨其潜在的分子机制。方法:分别采用高浓度葡萄糖(25 mmol·L^-1)和软脂酸(0.25 mmol·L^-1)诱导NIT-1胰岛β细胞建立高糖、高脂模型,予以小檗碱处理,用放射免疫法检测胰岛素水平,通过电镜观察自噬体的形成;然后予以腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂AICAR,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂Compound C,自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)进行干预,Western blot方法检测各组细胞AMPK的活化、自噬相关蛋白结节性硬化复合物1(tsc1)、微管相关蛋白1轻链蛋白3(LC3-Ⅱ)的表达。结果:在高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞中,小檗碱可以促进胰岛素的分泌和自噬体的形成,促进自噬相关蛋白tsc1,LC3-Ⅱ的表达,并活化其上游的AMPK。结论:小檗碱在高糖高脂的应激条件下可能通过促进自噬来发挥保护胰岛β细胞功能的作用,其分子机制可能与小檗碱调控AMPK-tsc1/LC3-II信号通路相关蛋白有关。

关键词：小檗碱自噬 NIT-1细胞 AMPK tsc1 LC3-Ⅱ

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结节性硬化症tsc1/tsc2基因突变的高通量测序快速诊断

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第1期32卷 92-95页

作者：黄昌艳江西赣州市立医院检验科江西赣州341000

目的建立结节性硬化症tsc1/tsc2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的tsc基因突变。方法对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增tsc1及tsc2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运... 详细信息

目的建立结节性硬化症tsc1/tsc2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的tsc基因突变。方法对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增tsc1及tsc2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运用常规测序验证。结果设计引物对tsc1及tsc2基因特异性扩增出7个长片段产物,产物长度介于13 kb^15 kb间;运用二代测序技术快速鉴定出10个致病突变,其中,7个突变位于tsc2基因,3个突变位于tsc1基因;所有突变经常规Sanger测序验证,结果一致。结论高通量二代测序技术可快速可靠诊断结节性硬化症tsc1、tsc2基因突变。

关键词：高通量测序结节性硬化 tsc1 tsc2 长链PCR

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5-Aza-CdR促进小鼠海马神经细胞HT22自噬增加通过启动tsc1/mTOR通路

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中国药理学通报 2020年第9期36卷 1265-1269页

作者：齐瑞芳包素雅邵国包头医学院低氧适应转化医学重点实验室基础医学与法医学院包头医学院神经科学研究所内蒙古包头014060 四川大学华西临床医学院四川成都610041

目的研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)能否诱导小鼠海马神经细胞HT22产生自噬对以及tsc1/mTOR通路是否参与其中。方法通过体外培养HT22细胞,5-Aza-CdR孵育24 h后,采用MTS检测对细胞活力的影响。采用RT-PCR... 详细信息

目的研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)能否诱导小鼠海马神经细胞HT22产生自噬对以及tsc1/mTOR通路是否参与其中。方法通过体外培养HT22细胞,5-Aza-CdR孵育24 h后,采用MTS检测对细胞活力的影响。采用RT-PCR和Western blot,检测tsc1、mTOR和LC3的mRNA和蛋白表达水平;采用组织免疫荧光的方法检测tsc1在不同组别HT22细胞中的表达;通过转染tsc1质粒,检测tsc1/mTOR途径在自噬中的作用。结果10μmol·L^-15-Aza-CdR可降低HT22细胞的活力,5-Aza-CdR使tsc1 mRNA和蛋白表达水平增加,p-mTOR(Ser2448)蛋白水平降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;过表达tsc1后小鼠海马HT22细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。结论5-Aza-CdR可以诱导HT22自噬增加,可能是通过启动tsc1/mTOR通路。

关键词： 5-Aza-CdR HT22细胞自噬 tsc1 mTOR 细胞活力

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低氧预适应对小鼠海马神经保护作用机制研究——基于tsc1/mTOR/自噬信号通路

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科技导报 2022年第13期40卷 107-113页

作者：齐瑞芳李娜吕军石瑞丽马宝慧时静华郝肖琼邵国内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院包头014040 内蒙古低氧适应转化医学重点实验室包头014040 广东省深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心深圳518172

为研究低氧预适应(HPC)对小鼠海马神经保护作用的机制,采用Western Blot方法检测对照组、低氧组、低氧预适应组3组实验小鼠的tsc1、mTOR和磷酸化mTOR及LC3蛋白的表达,验证tsc1/mTOR/自噬通路是否参与HPC对小鼠海马的神经保护作用。通过... 详细信息

为研究低氧预适应(HPC)对小鼠海马神经保护作用的机制,采用Western Blot方法检测对照组、低氧组、低氧预适应组3组实验小鼠的tsc1、mTOR和磷酸化mTOR及LC3蛋白的表达,验证tsc1/mTOR/自噬通路是否参与HPC对小鼠海马的神经保护作用。通过体外HT22细胞转染tsc1-peGFP,给予低氧刺激后,采用MTS法检测细胞活性,进一步确定tsc1在低氧条件下的神经保护作用。结果显示,HPC可增加小鼠低氧耐受时间;与对照组相比,HPC组tsc1蛋白表达升高,磷酸化mTOR蛋白表达下降;体外转染eGFP-tsc1质粒组与空载组相比,细胞活性增强。结果表明HPC可能通过上调tsc1表达,下调mTOR磷酸化水平激活自噬对小鼠海马发挥神经保护作用。

关键词：低氧预适应 tsc1 mTOR 自噬神经保护

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tsc1/tsc2二聚体及其在细胞生长调控中的作用

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生物技术通报 2013年第9期29卷 38-42页

作者：秦毅王彦凤王志钢内蒙古大学生命科学学院呼和浩特010021

tsc1和tsc2是常染色体基因,在体内作为抑癌基因广泛表达,表达产物Hamartin/tsc1和Tuberin/tsc2直接相互作用形成异二聚体(tsc1/tsc2)而起作用。tsc1和tsc2突变可导致一种显性遗传性多系统并发症,即复合型结节性硬化症(tuberous sclerosi... 详细信息

tsc1和tsc2是常染色体基因,在体内作为抑癌基因广泛表达,表达产物Hamartin/tsc1和Tuberin/tsc2直接相互作用形成异二聚体(tsc1/tsc2)而起作用。tsc1和tsc2突变可导致一种显性遗传性多系统并发症,即复合型结节性硬化症(tuberous sclerosis complex,tsc),具有很高的表现度和多样的并发表征,成人和小孩分别有1/8 000和1/6 000的几率受到tsc的影响。tsc1/tsc2能响应生长因子、胰岛素及各类环境胁迫信号,并发挥其靶向小G蛋白Rheb的GAP(GTPase active protein,GAP)活性,经由Rheb/mTORC1(mammalian target of rapamycin complex1)模式信号途径来调控细胞生长、分化及迁移并在胚胎发育及机体代谢过程中发挥重要的功能。综述tsc1和tsc2的分子遗传特性及其产物tsc1/tsc2在细胞生长调控中的作用。

关键词： tsc1 tsc2 细胞生长信号通路

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miR-21靶向猪tsc1和PPP3CA基因的初步鉴定

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畜牧兽医学报 2013年第6期44卷 985-992页

作者：彭兴谢炳坤唐中林周荣敖红黄生强李奎湖南农业大学动物科学技术学院长沙410128 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 广西畜牧研究所南宁530001

旨在初步鉴定miR-21靶向肌肉发育相关的基因。通过靶标预测网站发现结节性硬化症蛋白1基因(tsc1)和蛋白磷酸酶3催化亚基-α-亚型基因(PPP3CA)基因的3′非编码区(3′UTR)均具有与miR-21结合的潜在靶位点;以通城猪为试验材料,扩增其tsc1和... 详细信息

旨在初步鉴定miR-21靶向肌肉发育相关的基因。通过靶标预测网站发现结节性硬化症蛋白1基因(tsc1)和蛋白磷酸酶3催化亚基-α-亚型基因(PPP3CA)基因的3′非编码区(3′UTR)均具有与miR-21结合的潜在靶位点;以通城猪为试验材料,扩增其tsc1和PPP3CA基因的3′UTR,经NotⅠ和XhoⅠ双酶切后回收目的片段,连接到双荧光素酶载体psiCHECK中;将重组载体pCHE-tsc1-3′UTR和pCHE-PPP3CA-3′UTR分别转染到猪髋动脉内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)中,检测其荧光素酶活性。结果显示,当2个靶标载体分别与miR-21共转时,miR-21过表达组在PIEC细胞和PK15细胞中的荧光素酶活性均显著低于对照组(P1可能靶向调控tsc1和PPP3CA的表达,本研究为深入研究miR-21的生物学功能和作用机制等提供了基础。

关键词： miR-21 猪 tsc1 PPP3CA 靶标

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稳定表达tsc1/tsc2蛋白质复合物的293T细胞系的建立

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中国细胞生物学学报 2012年第12期34卷 1215-1219页

作者：闫丽君吴更上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

我们使用Clonetech的同源重组酶连接人tsc1、tsc2全长蛋白编码cDNA ORF到pBudCE4.1真核细胞双元表达载体上,用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒pBudCE4.1/tsc2/tsc1导入293T细胞,用含125μg/mL Zeocin的培养基筛选稳定表达tsc1/tsc2蛋白的细胞株,并用Western blot方法鉴定稳转细胞株的稳定性。该实验成功建立了稳定表达tsc1/tsc2蛋白的293T细胞系,从而为今后研究tsc1/tsc2蛋白的结构与功能提供实验基础。

关键词： tsc1 tsc2 稳转细胞系真核细胞双元表达载体 Zeocin

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tsc1在膀胱尿路上皮癌中的表达情况及其临床意义

TSC1在膀胱尿路上皮癌中的表达情况及其临床意义

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作者：邓飞吉林大学

学位级别：硕士

目的:通过检测tsc1在正常膀胱组织与膀胱膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况,研究tsc1与膀胱膀胱尿路上皮癌的早期诊断、临床病理以及预后的关系。方法:选取膀胱尿路上皮癌组织51例,正常膀胱组织5例。运用免疫组化的方法检测tsc1在膀胱尿... 详细信息

目的:通过检测tsc1在正常膀胱组织与膀胱膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况,研究tsc1与膀胱膀胱尿路上皮癌的早期诊断、临床病理以及预后的关系。方法:选取膀胱尿路上皮癌组织51例,正常膀胱组织5例。运用免疫组化的方法检测tsc1在膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱组织中的表达情况,并结合患者的临床资料分析讨论tsc1与膀胱尿路上皮癌的关系。结果:51例膀胱尿路上皮癌组织中tsc1的阴性表达率为58.8%,其中非肌层浸润组(Ta-T1)中tsc1的阴性表达率为52.4%,肌层浸润组(T2-)中tsc1的阴性表达率为88.9%,差异有统计学意义(Ptsc1的阴性表达率为44.4%,高分级组中tsc1的阴性表达率为75.0%,差异有统计学意义(P12-36个月,随访的45例膀胱癌患者中其中复发者共19人,tsc1在复发组中的阴性表达率为73.7%,在未复发组中的阴性表达率为38.5%,差异有统计学意义(Ptsc1的表达情况在肿瘤大小、患者性别以及患者年龄方面无明显差异(P>0.05)。结论:tsc1在膀胱尿路上皮癌组织中的阴性表达率明显高于tsc1在正常膀胱组织中的阴性表达率,而且tsc1的表达与膀胱尿路上皮癌的临床分期、病理分级以及是否复发密切相关。可用于膀胱癌的早期诊断、临床分期、病理分级及预后评估。

关键词：膀胱尿路上皮癌抑癌基因 tsc1 免疫组化

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tsc1/tsc2调控人胚肺成纤维细胞HELF增殖及分化的研究

TSC1/TSC2调控人胚肺成纤维细胞HELF增殖及分化的研究

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作者：陈晨安徽医科大学

学位级别：硕士

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是受多种因素调控的肺间质失常造成的,如肺部肿瘤的放疗与化疗等。肺纤维化的发生特别受大量细胞因子的影响。肺成纤维细胞在肺部结构与功能的形成与维持上有重要的作用。目前针对肺纤维化的治疗以糖... 详细信息

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是受多种因素调控的肺间质失常造成的,如肺部肿瘤的放疗与化疗等。肺纤维化的发生特别受大量细胞因子的影响。肺成纤维细胞在肺部结构与功能的形成与维持上有重要的作用。目前针对肺纤维化的治疗以糖皮质激素、细胞毒性药物为主要药物,但是效果不是很良好,副作用多。探讨肺纤维化的发病机制。研究治疗肺纤维化的可能的新靶点,是国内外药物研究的趋势。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,可以接受多种信号通路的信号刺激,激活转录并能促进细胞的生长与增殖。多篇文献报道,负调控mTOR可以负性调控纤维化。位于mTOR信号通路的上游的tsc1-tsc2肿瘤抑制因子,在基因表达正常的情况下可以负性调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶,阻断该信号通路。tsc1的基因定位9q34.3, tsc2的基因定位于16P13.3[4,5],分别编码错构素及结节素。文献报道高水平的结节素可以负调控细胞增殖,并且低水平的结节素会加快细胞的增殖。错构素也可以负调控细胞增殖。最近研究发现,活化的雷帕霉素靶蛋白激酶信号通路可以促进肾成纤维细胞的激活,并且敲除tsc1基因的转基因小鼠可以显示出肾间质纤维细胞的激活以及肾纤维化。那么tsc1、tsc2是否可以抑制纤维化?本文主旨就在探讨tsc1、tsc2在肺纤维化疾病中的角色。本实验通过观察tsc1、tsc2对HELF细胞的增殖及转分化的影响,并探讨其潜在的作用机制。主要研究内容总结如下：1. tsc1、tsc2在HELF细胞中的基因产物的表达本实验通过Western blot法检测采用TGF-β1刺激细胞HELF后tsc1、tsc2的基因产物表达情况。结果显示,TGF-β1刺激组中tsc1、tsc2的表达明显低于正常组。2.过表达tsc1、tsc2对HELF细胞增殖及分化的作用结果显示,转染pcDNA3-HA3-tsc1可以增加tsc1在HELF中的表达,进一步研究pcDNA3-HA3-tsc1对HELF周期的影响,pcDNA3-HA3-tsc1可通过促使细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期及S期细胞比例降低,影响HELF细胞的增殖。同时,pcDNA3-HA3-tsc1可以降低HELF中a-SMA、Collagen I蛋白的表达水平。表明上调tsc1的表达可负调控HELF的增殖与分化。进一步研究pcDNA3-FLAG-tsc2对HELF周期的影响,结果显示,pcDNA3-FLAG-tsc2可通过促使细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期及S期细胞比例降低,负调控HELF细胞的增殖。同时,pcDNA3-FLAG-tsc2可以降低HELF中a-SMA、Collagen I蛋白的表达水平。表明上调tsc2的表达可负调控HELF的增殖与分化。3. HELF中tsc1、tsc2基因甲基化程度采取焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法用于探讨HELF细胞中tsc1、tsc2基因的甲基化程度。TGF-β1刺激组的tsc1基因的3个检测位点的甲基化程度均要高于正常组。TGF-β1刺激组的tsc2基因的6个检测位点中的5个的甲基化程度要高于正常组。5-azadC对HELF细胞的作用被检测,Western blot结果显示2μg/m 15-azadC明显上调了由TGF-β1引起的tsc1、tsc2降低的表达。4. MeCP2对HELF中tsc1、tsc2的影响Western blot检测TGF-β1刺激的HELF中MeCP2蛋白表达随着时间的增进而升高。给予TGF-β1体外诱导肺纤维化模型,再在HELF细胞中转染siRNA-MeCP2, Western blot检测结果显示MeCP2、a-SMA及Collagen I蛋白表达均受siRNA-MeCP2抑制,同时tsc1、tsc2基因产物的蛋白表达水平较TGF-p1组升高。体外诱导肺纤维化模型,再在HELF细胞中转染pEGFP-C2-MeCP2, Western blot检测结果显示MeCP2、a-SMA及Collagen I蛋白表达均上调。同时tsc1、tsc2基因产物蛋白表达水平较TGF-β1组较低。以上结果表明上调tsc1/tsc2基因产物表达可以抑制HELF的增殖与分化,对肺纤维化具有一定的保护作用,其在TGF-P刺激的HELF中表达低的机制可能与DNA甲基化相关。

关键词： tsc1 tsc2 肺纤维化 HELF DNA甲基化 MeCP2

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