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RPAP3蛋白中tpr结构域的功能研究

现代生物医学进展 2012年第12期12卷 2245-2249,2244页

作者：李靓云唐超陈霞李建民南京医科大学基础医学院江苏南京210029

目的:构建针对RPAP3 tpr区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响。方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能;分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位;通过... 详细信息

目的:构建针对RPAP3 tpr区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响。方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能;分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位;通过酵母双杂交和GST-Pulldown实验研究RPAP3与HSP70的相互作用及作用靶点;构建慢病毒载体pLJM.1-RPAP3,转染293T细胞,收病毒感染MCF7细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞系,流式细胞分析对细胞周期的影响。结果:RPAP3在多物种广泛存在,有高度保守性;蛋白存在典型核定位信号,激光共聚焦显微镜下,GFP标记的RPAP3蛋白主要分布在细胞核;酵母双杂交和GST-Pulldown实验证实RPAP3与HSP70间存在相互作用,且作用发生在RPAP3的三联tpr结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间;流式细胞显示RPAP3 tpr区域的高表达阻滞细胞周期且凋亡增加。结论:RPAP3与HSP70间的相互作用发生在RPAP3的三联tpr结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间;构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响。

关键词： tpr结构域亚细胞定位蛋白相互作用细胞周期

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

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军事医学科学院院刊 2005年第4期29卷 316-320页

作者：王生余原野侯春梅于晓妉军事医学科学院基础医学研究所北京100850

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上... 详细信息

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端tpr结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box(-)。结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。

关键词：热休克蛋白70羧基端作用蛋白基因表达 tpr结构域 U-box结构域突变卵巢肿瘤

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

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生物技术通报 2014年第11期30卷 119-124页

作者：平海涛王玉萍王东霞周晓洁甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室甘肃省干旱生境作物学国家重点实验室培育基地兰州730070 甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070 甘肃农业大学园艺学院兰州730070

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3... 详细信息

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个tpr结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。

关键词：马铃薯 STI-LIKE基因 tpr结构域株型发育

多拷贝pilA基因功能暨水平转移基因hdsp作用机制的初步研究

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多拷贝pilA基因功能暨水平转移基因hdsp作用机制的初步研究

作者：谭在高山东大学

学位级别：硕士

对已测序粘细菌基因组的分析表明,某一基因在粘细菌的基因组中可能会存在多个拷贝。多拷贝基因的存在被认为是粘细菌适应其复杂社会学行为的结果。标桩菌和堆囊菌的基因组中均存在多个拷贝的pilA基因,pilA基因编码的pilin蛋白组装成type... 详细信息

对已测序粘细菌基因组的分析表明,某一基因在粘细菌的基因组中可能会存在多个拷贝。多拷贝基因的存在被认为是粘细菌适应其复杂社会学行为的结果。标桩菌和堆囊菌的基因组中均存在多个拷贝的pilA基因,pilA基因编码的pilin蛋白组装成type four pili （TFP）,而TFP在粘细菌的社会学行为中起到了重要的作用。为了对基因组中存在的多拷贝pilA基因进行功能分析,以分析这些不同拷贝的pilA基因之间是否存在功能差异,我们以*** 17044中的4个拷贝的pilA基因作为研究对象,分析了这4个拷贝的pilA及其编码的pilin蛋白的序列特征,并利用E. ***穿梭载体pZJY41,通过基因回补的方法,将这4各拷贝的pilA基因分别回补入*** DK10410（ApilA）,并分析了各回补菌株的社会学行为的变化。结果表明,所有回补菌株的胞外多糖EPS产量相对于DK10410而言,均没有得到提高。同时,菌株的群体运动能力也没有得到增强。但是在发育阶段,包含有其中pilA-1基因的回补菌株YL1101却恢复了子实体的形成能力,并且菌株的孢子形成能力明显高于其他拷贝pilA基因的回补菌株。菌株混合发育实验的结果也表明,该回补菌株YL1101与具有相同遗传背景、但TFP不同的DK1622株菌在发育阶段存在着相互识别。另外,将回补菌株与TFP本源菌*** 17044混合发育之后,回补菌株YL1102、YL1103、YL1104均恢复了子实体的形成能力。推测,可能是*** 17044中存在着某类组分（如EPS等）能够与回补菌株形成的TFP相互作用,激发回补菌株的子实体形成。综上所述,*** 17044中存在有多个拷贝的pilA基因,但是这些pilA基因的功能却并不完全一致,其中pilA-1基因在菌株的发育和识别过程中起到重要作用。 Hdsp,在前期工作中被证明是海洋耐盐粘球菌***-1通过水平转移而来的外源基因,在陆地模式粘球菌中并不存在。hdsp基因插入失活使得突变株YLH0401的EPS产生能力、S运动能力、发育能力都有不同程度的降低甚至丧失,并且突变株在液体培养条件下由聚团生长转变成分散生长。为了研究*** HW-1中通过水平转移（HGT）获得的hdsp基因的功能发挥是否具有广泛性,本文尝试利用E. ***穿梭载体pZJY41以及attP-attB位点特异性整合载体pSWU30为载体,将*** HW-1中的hdsp基因转移入陆地粘球菌研究的模式菌株*** DK1622中,通过RT-PCR的分析,确认hdsp基因能够在转化菌株中进行表达。对转化菌株的社会学行为进行研究,结果发现,包含有hdsp基因的DK1622转化菌株的胞外多糖EPS产生量提高,结合hdsp基因失活使得YLH0401社会学行为发生的变化,可以表明,hdsp基因可能在调控粘球菌EPS的产生过程中起到重要作用。生物信息学预测hdsp基因编码的Hdsp蛋白只包含有4个分散的tpr结构域,而tpr结构域在介导蛋白质互作中起到重要作用。为了进一步阐明hdsp基因在*** HW-1中的作用机制,找出与其相互作用的上下游组分,我们成功构建了基于表达载体pGEX-6P-1的截短Hdsp蛋白的表达载体,并在E. coli中通过优化条件,获得了只包含有tpr结构域的截短Hdsp蛋白的可溶性表达,纯化了GST-Hdsp蛋白分子,以Hdsp蛋白分子为诱饵,并通过GST-pulldown实验和后续的质谱鉴定,获得了在HW-1体内能够与Hdsp蛋白互作的蛋白分子信息,其中包含有若干重要的与胞外多糖EPS产生相关的蛋白组分,初步阐明了hdsp基因的作用机制。

关键词： S.aurantiaca 17044 多拷贝pilA基因 Hdsp蛋白 tpr结构域

番茄丛矮病毒复制蛋白p33与拟南芥CHIP蛋白的互作机制

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番茄丛矮病毒复制蛋白p33与拟南芥CHIP蛋白的互作机制

作者：王隆燊福建农林大学

学位级别：硕士

番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)的代表成员,是一种典型的正单链RNA病毒。由于其基因组较小、编码蛋白较少、复制效率高、土传方式传播,自然寄主较少、感病植... 详细信息

番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)的代表成员,是一种典型的正单链RNA病毒。由于其基因组较小、编码蛋白较少、复制效率高、土传方式传播,自然寄主较少、感病植物致死率高等特性,TBSV被视为研究植物正义RNA病毒复制机制较为理想、较为安全的模式病毒之一。复制是病毒侵染寄主细胞周期中最中心的环节,即病毒以其自身基因组为模板,在病毒编码的复制蛋白以及不同寄主因子的帮助下,复制产生大量子代基因组的过程。在TBSV复制阶段,其复制蛋白p33会招募寄主的膜组分、磷脂类、肌动蛋白网络以及其他寄主蛋白等到过氧化物酶体膜上建立病毒复制场所(virus replication compartments,VRCs)。迄今为止,虽然已有大量的寄主因子被鉴定能与其复制蛋白p33互作,但是它们的互作机制仍不清楚,值得深入探索。由于蛋白结构的特异性,大量带有tpr结构域(tetratricopeptide repeat domain)的寄主蛋白具有强大的蛋白与蛋白互作功能。目前已有不少研究表明该类蛋白能与p33互作,并且在TBSV复制过程中有着重要的功能。拟南芥CHIP蛋白(AtCHIP)是一个含有tpr结构域的特殊蛋白,因为它是参与寄主细胞泛素化蛋白降解系统中重要的E3连接酶,那么它是否也能和p33互作呢?在本研究中,通过酵母膜系统双杂交、体外Pull down、本氏烟叶片中蛋白共定位等实验发现,TBSVp33与AtCHIP有着强烈的相互作用,并且能将该蛋白招募到聚集的过氧化物酶体上。在本氏烟中瞬时超表达AtCHIP显著抑制了TBSV在侵染叶和系统叶的积累量。同时,在超表达AtCHIP的本氏烟叶片后会出现强烈的细胞坏死现象,DAB染色结果显示是大量ROS产生。然而当提前接种TBSV或者提前表达p33后,AtCHIP超表达叶片引起的细胞坏死和ROS迸发受到一定程度的抑制。另外,过表达AtCHIP可特异性地介导p33的降解,然而在MG132的作用下,p33的积累量得到一定程度的恢复。由此表明,AtCHIP可特异性地靶标TBSV复制蛋白p33,从而通过26S蛋白酶体将其降解,但是这种强烈的相互作用又可减缓AtCHIP介导的大量ROS迸发。综上所述,本研究初步发现了AtCHIP作为一种含有tpr结构域的E3连接酶与TBSV复制蛋白p33之间的互作在病毒侵染过程中的重要意义,为下一步深入探究病毒与寄主互作以及制定高效的抗病毒策略提供了新的思路。

关键词：番茄丛矮病毒复制 tpr结构域 E3连接酶 ROS迸发

马铃薯淀粉酶StBAM9互作蛋白的分离与鉴定

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马铃薯淀粉酶StBAM9互作蛋白的分离与鉴定

作者：彭晓君华中农业大学

学位级别：硕士

马铃薯(Solanum tuberosum L.)因其丰富全面的营养得到广泛的使用,其加工产业中的高附加值产品薯条薯片等,因其独特的风味而备受人们喜爱,然而马铃薯中的低温糖化现象严重阻碍了薯条薯片等油炸加工产品的发展。淀粉是马铃薯块茎的主要... 详细信息

马铃薯(Solanum tuberosum L.)因其丰富全面的营养得到广泛的使用,其加工产业中的高附加值产品薯条薯片等,因其独特的风味而备受人们喜爱,然而马铃薯中的低温糖化现象严重阻碍了薯条薯片等油炸加工产品的发展。淀粉是马铃薯块茎的主要储能形式,前人研究表明,淀粉处于淀粉-糖代谢的源头,是造成低温糖化的主要因素之一,其中β-淀粉酶9(StBAM9)尽管检测不到淀粉酶活性,但对马铃薯的低温糖化有着重要作用,为了研究这类无β-淀粉酶活性的蛋白是发挥功能的机制,本研究主要从蛋白水平对StBAM9互作蛋白进行了分离,并完成了验证及互作机制解析,主要研究结果如下:1.利用马铃薯低温糖化酵母文库对StBAM9的互作蛋白进行了筛选,得到了92个与StBAM9和StBAM9-P互作的蛋白,其中与StBAM9和StBAM9-P都互作的蛋白有12个,通过WEGO分析,两者的潜在互作蛋白在定位、分子功能以及生物学途径上相似,主要定位在细胞内,大多数是具有催化活性和结合功能的蛋白,且大部分蛋白富集在细胞、代谢、生物调控以及对刺激的响应的生物学途径上。通过酵母点对点验证,初步得到4个互作蛋白分别是StDUF842、Sttpr01660、Sttpr22129和Sttpr45174。2.为了明确StDUF842、Sttpr01660、Sttpr22129和Sttpr45174在马铃薯栽培种E3中不同组织及块茎低温处理下的表达模式,我们通过qRT-PCR进行定量分析,得到StDUF842、Sttpr22129在叶片中相对表达量高,Sttpr01660在叶片和成熟的薯块中相对表达量高,Sttpr4517334在成熟薯块中相对表达量高,其中Sttpr01660和Sttpr45174与StBAM9类似,在成熟的薯块中表达量高。叶片是马铃薯主要的产能器官,薯块是马铃薯主要的储能器官,推测它们都很有可能参与淀粉的降解。3.为了明确StDUF842、Sttpr01660、Sttpr22129、Sttpr45174的亚细胞位置,分别构建GFP融合表达载体GFP-StDUF842、GFP-Sttpr01660、GFP-Sttpr22129、GFP-Sttpr45174,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达得到StDUF842、Sttpr01660、Sttpr22129、Sttpr45174都定位于细胞质。4.为了进一步明确互作蛋白与StBAM9在植物细胞中的互作部位,我们通过BiFC对StDUF842、Sttpr01660、Sttpr22129、Sttpr45174与StBAM9进行互作验证,发现只有Sttpr01660与StBMA9互作于淀粉粒上,另外Sttpr01660与定位在质体基质中的β-淀粉酶1(StBAM1)互作于细胞质。另外,GST pull down结果表明Sttpr01660与StBAM9有互作,且还发现Sttpr45174与StBAM9有着较强的互作。而前期研究表明StBAM9定位在淀粉上,由此我们推测Sttpr01660可能在细胞质中与StBAM1互作,形成复合体,并通过StBAM9的招募,到达淀粉粒上,从而实行淀粉粒上淀粉降解的功能;此外,是否存在Sttpr45174等其他蛋白参与这个过程,还有待于进一步确定。5.为了明确Sttpr01660、StBMA1与StBMA9间互作的区段,我们以不同的Sttpr01660短截区段与StBMA9进行酵母点对点实验,结果表明Sttpr01660完整的tpr domain区段(第181到277个氨基酸区段)才能与StBMA9互作。通过NCBI对StBAM1进行结构域的预测,发现第1到85个氨基端区段有一个质体转运肽,第111到542个氨基端区段为葡糖基水解酶结构域。通过将水解结构域进行短截,我们得到StBAM1的第330到413个氨基酸区段与StBAM9-P互作。通过NCBI对StBAM9进行结构域的预测,发现第1到63个氨基端区段有一个质体转运肽,第88到506个氨基端区段为葡糖基水解酶结构域。通过将水解结构域进行短截,我们得到StBAM9的第238到386个氨基酸区段与StBAM1互作。StBAM1和StBAM9这两个短截的区段里含有两个相同的底物结合位点(赖氨酸和组氨酸),推测StBAM9可能借助StBAM1行使降解淀粉的功能。6.通过StBAM9干涉株系中直链和支链淀粉含量测定结果表明,在4℃30 d处理条件下,支链淀粉的降解速度比直链淀粉的降解速度慢,StBAM9更青睐于支链淀粉,我们可以进一步通过蛋白体外添加实验,明确互作蛋白与StBAM9可能的功能机制。此外,StBAM9干涉株系及对照的淀粉磷含量测定结果表明干涉株系与对照E3相比无显著差异,说明StBAM9调控的淀粉降解可能不是通过淀粉磷酸化的途径。

关键词：淀粉降解蛋白互作直链淀粉支链淀粉 β-淀粉酶9 tpr结构域 β-淀粉酶1

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家蚕中一未知基因的生物信息学分析

邢台学院学报 2011年第2期26卷 189-190页

作者：牛伟涛邢台学院生物化学系河北邢台054001

对家蚕中一未知基因进行生物信息学分析,结果显示:该基因开放阅读框大小为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31.1kD,等电点为4.75;该基因编码蛋白含有tpr(Tetratrico Peptide Repeat)结构域,具有个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶... 详细信息

对家蚕中一未知基因进行生物信息学分析,结果显示:该基因开放阅读框大小为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31.1kD,等电点为4.75;该基因编码蛋白含有tpr(Tetratrico Peptide Repeat)结构域,具有个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、肉豆蔻酰基化位点、糖基化位点及cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化功能位点。

关键词：家蚕基因 tpr结构域生物信息学