多拷贝pilA基因功能暨水平转移基因hdsp作用机制的初步研究

作     者：谭在高 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李越中

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：S.aurantiaca 17044 多拷贝pilA基因 Hdsp蛋白 TPR结构域 

摘      要：对已测序粘细菌基因组的分析表明,某一基因在粘细菌的基因组中可能会存在多个拷贝。多拷贝基因的存在被认为是粘细菌适应其复杂社会学行为的结果。标桩菌和堆囊菌的基因组中均存在多个拷贝的pilA基因,pilA基因编码的pilin蛋白组装成type four pili （TFP）,而TFP在粘细菌的社会学行为中起到了重要的作用。为了对基因组中存在的多拷贝pilA基因进行功能分析,以分析这些不同拷贝的pilA基因之间是否存在功能差异,我们以*** 17044中的4个拷贝的pilA基因作为研究对象,分析了这4个拷贝的pilA及其编码的pilin蛋白的序列特征,并利用E. ***穿梭载体pZJY41,通过基因回补的方法,将这4各拷贝的pilA基因分别回补入*** DK10410（ApilA）,并分析了各回补菌株的社会学行为的变化。结果表明,所有回补菌株的胞外多糖EPS产量相对于DK10410而言,均没有得到提高。同时,菌株的群体运动能力也没有得到增强。但是在发育阶段,包含有其中pilA-1基因的回补菌株YL1101却恢复了子实体的形成能力,并且菌株的孢子形成能力明显高于其他拷贝pilA基因的回补菌株。菌株混合发育实验的结果也表明,该回补菌株YL1101与具有相同遗传背景、但TFP不同的DK1622株菌在发育阶段存在着相互识别。另外,将回补菌株与TFP本源菌*** 17044混合发育之后,回补菌株YL1102、YL1103、YL1104均恢复了子实体的形成能力。推测,可能是*** 17044中存在着某类组分（如EPS等）能够与回补菌株形成的TFP相互作用,激发回补菌株的子实体形成。综上所述,*** 17044中存在有多个拷贝的pilA基因,但是这些pilA基因的功能却并不完全一致,其中pilA-1基因在菌株的发育和识别过程中起到重要作用。 Hdsp,在前期工作中被证明是海洋耐盐粘球菌***-1通过水平转移而来的外源基因,在陆地模式粘球菌中并不存在。hdsp基因插入失活使得突变株YLH0401的EPS产生能力、S运动能力、发育能力都有不同程度的降低甚至丧失,并且突变株在液体培养条件下由聚团生长转变成分散生长。 为了研究*** HW-1中通过水平转移（HGT）获得的hdsp基因的功能发挥是否具有广泛性,本文尝试利用E. ***穿梭载体pZJY41以及attP-attB位点特异性整合载体pSWU30为载体,将*** HW-1中的hdsp基因转移入陆地粘球菌研究的模式菌株*** DK1622中,通过RT-PCR的分析,确认hdsp基因能够在转化菌株中进行表达。对转化菌株的社会学行为进行研究,结果发现,包含有hdsp基因的DK1622转化菌株的胞外多糖EPS产生量提高,结合hdsp基因失活使得YLH0401社会学行为发生的变化,可以表明,hdsp基因可能在调控粘球菌EPS的产生过程中起到重要作用。 生物信息学预测hdsp基因编码的Hdsp蛋白只包含有4个分散的TPR结构域,而TPR结构域在介导蛋白质互作中起到重要作用。为了进一步阐明hdsp基因在*** HW-1中的作用机制,找出与其相互作用的上下游组分,我们成功构建了基于表达载体pGEX-6P-1的截短Hdsp蛋白的表达载体,并在E. coli中通过优化条件,获得了只包含有TPR结构域的截短Hdsp蛋白的可溶性表达,纯化了GST-Hdsp蛋白分子,以Hdsp蛋白分子为诱饵,并通过GST-pulldown实验和后续的质谱鉴定,获得了在HW-1体内能够与Hdsp蛋白互作的蛋白分子信息,其中包含有若干重要的与胞外多糖EPS产生相关的蛋白组分,初步阐明了hdsp基因的作用机制。