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球孢白僵菌诱导巴氏新小绥螨toll通路的表达模式及Spz基因的功能验证

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球孢白僵菌诱导巴氏新小绥螨Toll通路的表达模式及Spz基因的功能...

作者：况再银西南大学

学位级别：硕士

巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri Hughes作为我国已商业化生产的本土植绥螨,具有取食范围广、扩散力强等优点。而球孢白僵菌Beauveria bassiana是应用最广泛的生防真菌之一,具有良好的防治效果。将两者进行联合应用是一种联合防控新途径... 详细信息

巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri Hughes作为我国已商业化生产的本土植绥螨,具有取食范围广、扩散力强等优点。而球孢白僵菌Beauveria bassiana是应用最广泛的生防真菌之一,具有良好的防治效果。将两者进行联合应用是一种联合防控新途径,本课题组已筛选出球孢白僵菌的Bb025菌株对柑橘始叶螨具有高致病力却对巴氏新小绥螨侵染力较低,明确两者具有联合防控潜力。但巴氏新小绥螨对Bb025的耐受机理仍不明确,亟需探究。因此本研究以巴氏新小绥螨和Bb025为研究对象,利用RT-qPCR技术开展了Bb025诱导巴氏新小绥螨toll通路的响应模式研究并利用克隆技术对toll通路中起关键作用的Spz基因进行鉴定。还采用RNAi技术将Spz沉默后,检测toll通路其他基因和抗菌肽的表达情况,明确了Spz在toll通路中的作用。主要研究结果如下:1球孢白僵菌侵染对巴氏新小绥螨toll通路的影响将巴氏新小绥螨喷洒或取食Bb025孢子液30 min后,利用PCR技术检测了它们体内的含菌（白僵菌）情况,同时设立了阴性对照和空白对照组,结果只有喷洒和取食组检出白僵菌片段,表明Bb025孢子液在30 min以内即可被巴氏新小绥螨取食。在明确Bb025的侵入方式后,利用RT-qPCR技术研究了Bb025侵染后巴氏新小绥螨toll通路的响应模式,结果显示处理2 h后,PGRP、Spz、toll3、Myd88、Tube和Pelle不同程度的显著上调表达,抗菌肽defensin也上调表达,表明此时Bb025被取食后侵染巴氏新小绥螨并诱导引发了巴氏新小绥螨toll通路的免疫响应。4 h后,除Spz和toll1外其余基因均下调表达,defensin却显著上调表达,表达量比2 h时更高,表明toll通路基因已发挥作用并激活更多defensin产生。96 h后,toll通路大部分基因和defensin再次不同程度的显著上调表达,表明此时Bb025通过巴氏新小绥螨体壁侵入并诱导引发了toll通路的免疫响应。120 h后,除PGRP、Spz和toll1保持上调外,其余基因的表达趋于平稳,defensin却呈现出更高的表达量,表明此时toll通路基因已基本完成响应并诱导产生更多defensin以抵御侵染。综上所述,巴氏新小绥螨toll通路在Bb025被取食或体壁侵入诱导引发的免疫反应中均发挥了重要作用,并且也发现Spz基因在toll通路响应过程中发挥着重要作用。2巴氏新小绥螨Spz基因的克隆与不同螨态的表达谱解析基于转录组数据库筛选出Spz基因,利用RT-PCR技术克隆获得它的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其在巴氏新小绥螨体内作为胞外蛋白存在。通过多重序列比对发现,Nbspz含有7个半胱氨酸结构域,在进化过程中高度保守。通过构建系统发育树,发现Nbspz与同为蛛形纲的物种聚为一大支,表明它们的亲缘关系较近。还发现Nbspz与不同物种的Spz5相似度较高,表明Nbspz可能属于Spz type5家族。通过RT-qPCR技术研究了Spz在不同螨态中的表达谱,结果显示Nbspz在若螨、雌成螨和雄成螨中的表达量较高,表明Spz基因在巴氏新小绥螨若螨、雌成螨和雄成螨中为抵御病原菌的侵染发挥了重要的作用。3巴氏新小绥螨Spz基因在toll通路中的功能验证通过饲喂法将巴氏新小绥螨进行RNAi,获得了61%的沉默效率。与此同时,toll2、toll3、Myd88、Tube和Pelle均出现了不同程度的下调表达,其中toll2、toll3和Myd88与对照组相比有显著性差异,同时defensin也受其影响随之下调表达。由此说明,Spz基因在巴氏新小绥螨toll通路免疫应答过程中发挥着不可替代的作用。将Spz沉默并用Bb025处理后,巴氏新小绥螨的死亡率明显提高,缩短了LT50和LT95。处理后第7 d,当阴性对照组和空白对照组的累积死亡率分别为15%和15.6%的情况下,处理组的累积死亡率高达50.1%,表明RNAi后的巴氏新小绥螨对Bb025的敏感性明显提高。由此推断,Spz基因及Spz基因所在的toll通路在巴氏新小绥螨应对Bb025侵染过程中发挥着相当重要的作用。

关键词：巴氏新小绥螨球孢白僵菌 toll通路 Spz基因联合应用

黑腹果蝇miR-1000通过靶向Myd88负调控toll信号通路

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黑腹果蝇miR-1000通过靶向Myd88负调控Toll信号通路

作者：贾超龙南京师范大学

学位级别：硕士

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)通过先天免疫来抵御外来病原菌的入侵,其中,由抗菌肽和活性氧组成的体液免疫发挥着重要的作用。在黑腹果蝇中,toll通路和Imd通路调控着果蝇的体液免疫,而这两个通路具有高度的进化保守性。果蝇的toll... 详细信息

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)通过先天免疫来抵御外来病原菌的入侵,其中,由抗菌肽和活性氧组成的体液免疫发挥着重要的作用。在黑腹果蝇中,toll通路和Imd通路调控着果蝇的体液免疫,而这两个通路具有高度的进化保守性。果蝇的toll通路与哺乳动物的TLR(toll-like Receptor)通路同源,而Imd通路与TNF-α(Tumor necrosis factor-α)通路同源。近年来,虽然这两个通路的主要成分已经确定,但关于免疫如何被精确调控却知之甚少。而免疫的持续激活对机体是有损伤的,比如果蝇寿命的减少,生存率的下降等。因此,系统地开展黑腹果蝇免疫通路的调控机制,不仅有助于了解果蝇免疫稳态调控的机制,而且对哺乳动物免疫调控机制的研究也有重要的意义。在本论文中,我们在对黑腹果蝇进行藤黄微球菌(Micrococcus luteus)刺激后,发现miR-1000在刺激后,表达量显著上升。然后我们用藤黄微球菌感染miR-1000高表达果蝇以及miR-1000 KO果蝇后,我们发现miR-1000高表达果蝇体内的toll信号通路下游抗菌肽Drs(Drosomycin)的表达量显著下降,而相对应的miR-1000 KO果蝇体内Drs表达量显著上升,说明miR-1000确实参与到了toll通路的负调控中。然后,我们用生物信息学方法预测到了一些miR-1000的候选靶基因,其中在toll信号通路中发挥作用的有mod SP和Myd88。然后我们检测了miR-1000高表达果蝇以及miR-1000 KO果蝇在感染藤黄微球菌后Myd88和mod SP的表达情况。发现当miR-1000高表达后,Myd88和mod SP均下调,而在miR-1000 KO果蝇内,Myd88的表达有所回升,mod SP的表达没有显著变化。之后我们利用双荧光素酶报告系统,在S2细胞内对miR-1000与mod SP和Myd88的3′UTR(3′untranslated region)之间的关系进行了探究,。发现miR-1000能够下调带有Myd88 3′UTR的报告基因的表达,而不能下调带有mod SP 3′UTR的报告基因,说明Myd88是miR-1000的一个靶基因。为了进一步证明miR-1000在toll信号通路中的调控作用,我们利用miR-1000 sponge果蝇构建了miR-1000高表达的回补果蝇。结果发现对miR-1000的高表达进行回补后,Myd88和Drs的表达也回补,这进一步证明miR-1000是通过靶向Myd88来负调控toll信号通路。为了探究miR-1000对果蝇免疫力的影响,我们利用致死菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)刺激miR-1000高表达果蝇以及miR-1000 KO果蝇,发现miR-1000高表达果蝇的生存率显著下降,而miR-1000 KO果蝇的生存率则上升,说明miR-1000的异常表达扰乱了果蝇的免疫稳态。所以,我们得出结论:miR-1000在免疫后期,通过靶向Myd88的m RNA,从而抑制了Myd88的表达,进而抑制了果蝇的toll通路。

关键词：黑腹果蝇 miR-1000 toll通路 Myd88 先天免疫

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对虾toll样受体通路研究进展

福建轻纺 2017年第5期 40-42页

作者：蒙苗吴文林泉州师范学院海洋与食品学院福建泉州362000

对虾是我国重要的海水养殖品种,但频繁爆发的病害威胁着对虾养殖的可持续发展。toll通路是对虾重要的免疫应答通路,在对虾的抗病原体感染中起重要作用。文章综述了国内外关于对虾toll通路的最新研究进展,总结了国内外的研究成果,指出对... 详细信息

对虾是我国重要的海水养殖品种,但频繁爆发的病害威胁着对虾养殖的可持续发展。toll通路是对虾重要的免疫应答通路,在对虾的抗病原体感染中起重要作用。文章综述了国内外关于对虾toll通路的最新研究进展,总结了国内外的研究成果,指出对虾toll通路研究的重要意义和未来的研究方向。

关键词：对虾 toll通路研究进展

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

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昆虫学报 2020年第7期63卷 798-806页

作者：李冰孙帆陶姗姗夏家凤叶崇军农业部蚕桑遗传改良重点实验室江苏镇江212018 安徽省农业科学院蚕桑研究所合肥230061

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase,PPO)激活通路和革兰氏阳... 详细信息

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase,PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的toll通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和toll途径的胞外级联反应的免疫通路。

关键词：家蚕自身免疫丝氨酸蛋白酶抑制剂酚氧化酶原抗菌肽 toll通路

一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响

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环境昆虫学报 2022年第6期44卷 1517-1527页

作者：蔡霓龙秀珍刘蓉吴雨欣曾宪儒农向群王广君涂雄兵张泽华中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 广西农业科学院植物保护研究所南宁530007 长江大学农学院湖北荆州434000

白僵菌是最具防治害虫潜力的一类昆虫病原真菌。本研究测定了球孢白僵菌Beauveria bassiana 237菌株对红火蚁Solenopsis invicta的感染毒力,并探究了白僵菌侵染对红火蚁免疫相关酶活性及相关基因表达的影响。结果显示,该白僵菌菌株对红... 详细信息

白僵菌是最具防治害虫潜力的一类昆虫病原真菌。本研究测定了球孢白僵菌Beauveria bassiana 237菌株对红火蚁Solenopsis invicta的感染毒力,并探究了白僵菌侵染对红火蚁免疫相关酶活性及相关基因表达的影响。结果显示,该白僵菌菌株对红火蚁的毒力较强,在孢子悬浮液108孢子/mL浓度下,对红火蚁的致死中时间LT50为5.288±0.2014 d;在104~108孢子/mL的不同浓度处理下,红火蚁死亡率随孢子浓度的增加而显著增加。经计算,第4~10天致死中浓度LC50值由8.82×106孢子/mL降低到8.95×105孢子/mL。红火蚁被球孢白僵菌感染后,体内保护酶和解毒酶发生了不同程度的改变。其中保护酶类酚氧化酶(PO)的活性在白僵菌处理后的第12 h已出现抑制,而在第24 h、48 h、72 h时均显著高于对照;超氧化物歧化酶(SOD)活性在12 h时与对照无显著差异,但在24~48 h阶段酶活显著上升,之后下降;过氧化物酶(POD)在较早时段保持与对照无显著差异水平,至中后期48~72 h出现持续升高。解毒酶类混合功能氧化酶系(MFO)的活性在整个检测时间段内表现为抑制-上升-抑制-上升的波动状态;谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性的变化与SOD相似,只在24~48 h阶段出现上升。白僵菌还导致红火蚁免疫信号通路toll途径相关基因表达量变化。在处理后12 h,识别因子GNBP1、Spaetzle即被激活,维持上调-回调波动趋势;而信号传递因子Myd88、pelle在检测的12~72 h内基本处于被抑制状态,只有Myd88在48 h时表达量上升;转录因子Dorsal以及抗菌肽Defensin在12~24 h都已被显著激活,而在后续48~72 h被抑制。综上所述,球孢白僵菌237菌株通过调节红火蚁酶活以及免疫相关基因的表达量实现成功侵染和致病作用,具有很高的生防应用价值。

关键词：球孢白僵菌红火蚁毒力酶活 toll通路免疫

MnMats，MnTaiman及一种高变C-型凝集素在日本沼虾先天免疫中的功能研究

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MnMats，MnTaiman及一种高变C-型凝集素在日本沼虾先天免疫中的功...

作者：麻福通南京师范大学

学位级别：硕士

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称河虾或青虾,是一种重要的淡水养殖虾类。其适应能力强,食性杂,繁殖力强,广泛分布于我国大小水域,是我国重要的养殖虾类之一。河虾肉质鲜美,营养丰富,在我国水产品市场广受欢迎。但随着现代工业... 详细信息

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称河虾或青虾,是一种重要的淡水养殖虾类。其适应能力强,食性杂,繁殖力强,广泛分布于我国大小水域,是我国重要的养殖虾类之一。河虾肉质鲜美,营养丰富,在我国水产品市场广受欢迎。但随着现代工业化进程的迅速发展,各地水域水质均受到不同程度破坏,加上养殖业自身发展的不健康和不规范,进一步加剧了养殖水域水环境的恶化,导致包括河虾在内的咸淡水经济虾类养殖受多种疾病困扰,而研究河虾先天免疫防御机制,可以对生产实践中的疾病防控进行有效指导。模式识别受体和免疫信号途径作为无脊椎动物先天免疫系统的重要组成部分,在无脊椎动物对抗病原微生物感染过程发挥重要作用。本论文首先对日本沼虾Hippo信号通路中Mats基因进行了研究。Yorkie是Hippo信号通路的转录因子,促进Cactus基因(toll信号通路)的表达。而Yorkie作为转录因子,行使功能时,需要与其它蛋白进行互作,Taiman是Yokie的一种互作蛋白,在该论文中,我们对Taiman基因的选择性剪切以及在免疫防御中的功能进行了初步研究。最后,我们对发现的一种高变C-型凝集素(在编码区,通过含有不同数目的重复单元,增加凝集素多样性)的功能进行了初步研究。***基因在日本沼虾先天免疫中的功能在本研究中,我们发现并命名了MnMats基因,获得了其cDNA序列,cDNA全长为1127bp,开放阅读框(ORF)大小为651bp,编码217个氨基酸长度的蛋白,含有一个Mob1hocein结构域。我们研究了其在日本沼虾中的组织分布情况,发现其在各个组织中均有分布,肝胰腺中表达量最大,而血细胞中最低。我们进一步研究了其在金黄色葡萄球菌/副溶血弧菌刺激时的表达模式,发现金黄色葡萄球菌刺激时,除血细胞和胃以外,各个组织MnMats均呈上调趋势。而当机体面对副溶血弧菌刺激时,除胃以外其他组织中MnMats也均上调。RNAi敲低MnMats后,发现多种抗菌肽表达受到了抑制。这些研究结果表明,作为Hippo信号通路中的重要组件,MnMats基因可能通过抑制Cactus基因的表达,促进抗菌肽的表达,从而参与了日本沼虾先天免疫防御。***基因在日本沼虾先天免疫中的功能我们在日本沼虾中发现并命名了MnTaiman基因。日本沼虾Taiman基因存在四种不同的转录本。其中最长的转录本cDNA全长为6894 bp,开放阅读框(ORF)全长为4998 bp,编码长度为1666个氨基酸的蛋白。含有一个PAS结构域、一个HLH结构域和一个PAS1结构域。半定量进行组织分布研究时,发现MnTaiman基因C末端存在选择性剪切,产生四种不同的剪切本,命名为TaiA、TaiB、TaiC、TaiD。qRT-PCR结果表明,MnTai-Total(TaiT)、TaiA、TaiB、及TaiD的组织分布相似,在各个组织中均有分布,并且在肝胰腺中高表达。但TaiC在胃组织中高表达。金黄色葡萄球菌/副溶血弧菌刺激下的表达模式实验,结果表明,除血细胞之外,在其他组织中TaiT及四种转录本呈现不同的表达模式。在血细胞中,病原刺激后基因均呈下调趋势。在河虾血细胞中,RNA干扰敲低MnTaiman,金葡萄球菌刺激后24h,ALF1表达显著增高。MnTaiman敲低后,副溶血弧菌刺激后24h,ALF1表达也明显上调。根据已有文献,Taiman和Yorkie互作,而Yorkie调节Cactus的表达。所以我们推测,MnTaiman通过调控Cactus的表达,负调控toll信号通路,从而抑制抗菌肽基因的表达。3.一种高变C-型凝集素功能研究我们在日本沼虾中发现一种C-型凝集素,由于其编码区含有不同数目的重复单元,因此,我们命名为repeat lectin-MnRlec。该蛋白含有一个信号肽、一个CLECT结构域,在这两个结构域之间包含一个含有不同数目重复单元的区域,该区域含有的串联重复可以高达9个,最少含有一个串联重复。在基因组上,我们也发现了含有不同数目重复单元的序列,因此我们推测,含有不同数目重复单元的凝集素,在基因组复制过程中,发生了滑动错配,导致基因多样性的产生。我们表达和纯化了三种分别含有1个、2个、3个串联重复单元的MnRlec蛋白,命名为MnRlec1、MnRlec2、MnRlec3。对这三种蛋白进行细菌结合实验,结果发现MnRlec1对副溶血弧菌的结合呈现出钙离子依赖的特征,MnRlec2和MnRlec3对副溶血弧菌的结合能力减弱。此外,MnRlec1、MnRlec2以及MnRlec3均表现出对大肠杆菌的结合能力,且这种结合不依赖于钙离子。通过我们的研究发现,MnRlec随着重复单元的增加,结合副溶血弧菌的能力减弱,这可能是病原和宿主在进化过程中进行博弈的结果。

关键词：日本沼虾 Hippo通路 toll通路 Taiman 选择性剪切 Mats C-型凝集素高变蛋白

家蚕主要免疫信号通路对不同病原微生物的感染应答

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家蚕主要免疫信号通路对不同病原微生物的感染应答

作者：刘佳宾苏州大学

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JAK/STAT、toll、Imd和RNAi通路是与昆虫天然免疫的相关的主要信号通路，为探讨家蚕天然免疫相关通路对不同微生物的感染应答差异，本研究用大肠杆菌（E. coli），灵菌（Serratia marcescens, Sm）、黑胸败血芽孢杆菌（Bacillusbombysep... 详细信息

JAK/STAT、toll、Imd和RNAi通路是与昆虫天然免疫的相关的主要信号通路，为探讨家蚕天然免疫相关通路对不同微生物的感染应答差异，本研究用大肠杆菌（E. coli），灵菌（Serratia marcescens, Sm）、黑胸败血芽孢杆菌（Bacillusbombyseptieus, Bab）、白僵菌（Beauveria bassiana, Beb），家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕质型多角体病毒(BmCPV)、家蚕浓核病毒(BmDNV)以及家蚕微孢子虫(Nosema bombycis, Nb)诱导，通过real-time PCR检测了Bmstat、Bmspz、BmPGRP-LB、BmPGRP-LE、Bmago2及Bmdrc2表达水平的变化，以期进一步分析家蚕的天然免疫机制;蚕类黄斑病毒（BmMLV）是一种能隐性感染家蚕及其培养细胞的病毒，为探讨BmMLV的隐性感染机制，本研究通过real-time PCR检测了toll、Imd、JAK/STAT、RNAi四大信号通路对BmMLV感染的免疫应答。取得的主要结果如下：一、抑制SOCS表达对JAK/STAT通路的调节作用为探讨家蚕BmSOCS2以及BmSOCS6对JAK/STAT信号通路的调节作用，将BmSOCS2、BmSOCS6特异性的siRNA转染家蚕BmN培养细胞，检测沉默BmSOCS2、BmSOCS6基因对Bmstat表达水平的影响，结果显示，4种SOSC2的siRNA对BmSOCS2基因的沉默效果并不明显，引起Bmstat基因的表达水平变化也不明显;用socs6-48siRNA处理培养细胞，BmSOCS6基因的表达水平下降了1.78倍，而Bmstat的基因表达上升了11.55倍，推测SOCS6是家蚕JAK/STAT通路的负反馈调节基因。二、JAK/STAT通路对细菌、真菌、BmNPV的免疫应答为研究家蚕JAK/STAT信号通路对细菌、真菌的免疫应答，5龄3天家蚕分别注射灭活的***、Sm以及Bab，6h后分别取实验组家蚕和对照组家蚕血液;4龄起蚕感染Beb，96h后分别取实验组家蚕和对照组家蚕血液;用real-time PCR检测样品中的Bmstat的转录水平。结果显示，家蚕感染不同细菌后，血液中Bmstat的转录水平没有明显变化，家蚕感染真菌后，血液中Bmstat的转录水平有明显变化，推测家蚕JAK/STAT信号通路对细菌的感染无应答，而对真菌的感染有应答。血细胞的免疫组化实验结果显示，感染BmNPV后，Bmstat表达水平提高，血细胞数目增加，且与STAT的表达偶联，推测血细胞的增殖、分化受JAK/STAT通路调节，BmNPV感染可激活JAK/STAT通路。三、toll通路对不同微生物的免疫应答为探讨家蚕toll信号通路对不同病原微生物的免疫应答差异，不同时期家蚕（大造）分别用不同的病原微生物诱导，通过real-time PCR检测toll信号通路受体基因Bmspz的转录水平，结果显示，注射PBS造成机体损伤可上调Bmspz的转录水平;家蚕感染Beb、BmDNV后，Bmspz表达水平上调，而感染细菌、病毒（BmCPV、BmNPV）以及Nb后，Bmspz的表达水平没有明显上升，推测家蚕对抗真菌应答受到toll信号通路调节，而对细菌、某些病毒以及微孢子虫的感染toll通路无明显应答。四、Imd通路对不同微生物的免疫应答为探讨家蚕Imd信号通路对不同病原微生物的免疫应答差异，家蚕用不同微生物进行诱导，通过real-time PCR检测Imd信号通路受体基因BmPGRP-LB、BmPGRP-LE的转录水平。结果显示，注射PBS造成机体损伤能上调BmPGRP-LB的转录水平，家蚕注射G-菌***和Sm，BmPGRP-LB的转录水平上调;家蚕感染白僵菌后，BmPGRP-LB的转录水平有所上调，家蚕感染病毒BmCPV、BmDNV、BmNPV后，BmPGRP-LB的转录水平有所上调，而家蚕感染Nb后，BmPGRP-LB的转录水平没有发生明显变化，感染Nb后，中肠中BmPGRP-LE的表达水平略有上升;家蚕感染G+菌Bab、G-菌Sm以及病毒BmDNV后，能上调BmPGRP-LE的转录水平，但在家蚕感染其他病原微生物时，并未发现BmPGRP-LE转录水平的明显变化。推测家蚕Imd信号通路主要负责调节G-细菌的应答，对BmCPV、BmDNV、BmNPV的感染应答可能通过间接方式激活Imd信号通路。五、RNAi通路对不同微生物的感染应答为了探讨RNAi信号通路对不同病原微生物的感染应答差异，家蚕用不同微生物进行诱导，通过real-time PCR检测RNAi信号通路中关键基因Bmago2、Bmdrc2的转录水平，结果显示，家蚕注射PBS后，B

关键词：家蚕 JAK/STAT通路 SOCS toll通路 Imd通路 RNAi通路 BmMLV 天然免疫

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环链虫草对二斑叶螨的酶活及基因影响

环链虫草对二斑叶螨的酶活及基因影响

作者：吴煜贵州师范大学

学位级别：硕士

二斑叶螨Tetranychus urticae（Koch）是一种全球性农业和园艺害螨,其在贵州省荞麦主产区上均有分布,发生量大时,造成落花落果,严重影响荞麦的产量,长期以来大量使用化学杀螨剂对其进行防治,使得害虫抗药性增强、农药残留严重、生态环... 详细信息

二斑叶螨Tetranychus urticae（Koch）是一种全球性农业和园艺害螨,其在贵州省荞麦主产区上均有分布,发生量大时,造成落花落果,严重影响荞麦的产量,长期以来大量使用化学杀螨剂对其进行防治,使得害虫抗药性增强、农药残留严重、生态环境污染,因此迫切需要开发寻找高效低毒的新型螨类生防制剂。环链虫草Cordyceps cateniannulata（又称为环链棒束孢Isaria cateniannulata）是最具潜力的新型生防制剂之一,已发现实验室条件下其对二斑叶螨的致死率达100%,田间施用10 d后的相对防效达80%以上。但环链虫草侵染过程中二斑叶螨体内的免疫机制尚不明确,亟需探究。因此本文研究环链虫草侵染二斑叶螨的过程中,螨体内保护酶、解毒酶的活性变化,分析CAT、GST相关基因、几丁质酶基因、toll通路相关基因表达的特异性,并加以验证,阐明二斑叶螨对环链虫草的免疫机制,为环链虫草作为二斑叶螨生物制剂的开发和使用提供科学依据。主要研究结果如下:1、二斑叶螨体内保护酶、解毒酶活性的变化环链虫草侵染二斑叶螨雌成螨后,螨体内保护酶、解毒酶系统均呈现先升高后降低的变化趋势。POD酶和MFO酶活性,4 h时达到最大值。分别为89.02 U/g、2.65 nmo L/min/g,CAT酶活性12 h时达到最大值为4820.00 nmo L/min/g,GST酶活性36 h达到最大值为1238.70 nmo L/min/g。表明二斑叶螨受环链虫草侵染后,螨体内处于逆境状态,自由基增多,保护酶、解毒酶等免疫系统酶系激活以应对环链虫草胁迫。2、二斑叶螨体内CAT、GST、几丁质酶基因、toll通路相关基因表达模式的变化环链虫草侵染二斑叶螨后,不同Tu CATs表达量出现先上升后下降的趋势,Tu CAT1、Tu CAT2、Tu CAT4表达量在4h出现显著上调,达到最大值为为2.63倍、3.26倍、2.19倍,Tu CAT3在36 h时出现基因上调表达,此时表达量达到最大值为1.30倍;不同Tu GSTs表达量出现先下降后上升的趋势,在4 h时均出现表达量下调现象,在36h时Tu GST2、Tu GST3表达量达到最大值分别为1.50倍、4.23倍,在48 h时Tu GST1、Tu GST4表达量达到最大值分别为1.29倍、1.72倍。不同几丁质酶基因（Tu CHTs）在环链虫草XS08-1诱导下均出现表达量降低,不同类型Tu CHTs在不同时段的响应速度和强度存在差异,相同类型Tu CHTs表达趋势相似;Tu CHT7、Tu CHT8、Tu CHT9为I型几丁质酶,Tu CHT11、Tu CHT12为II型几丁质酶,I、II型几丁质酶的功能均与昆虫的蜕皮过程有关,推测可能通过调节昆虫体壁几丁质含量从而起到免疫防御作用,从而导致基因表达模式较为相似,呈先下降后上升模式,Tu CHT10为VII型几丁质酶,具有一定抑菌作用,导致其趋势呈下调表达。不同toll通路相关基因在环链虫草XS08-1诱导下均能表达,4 h时Tu Dorsal表达上调,此时螨体内toll通路被激活,12 h时除Tu toll4、Tu toll8外其余基因均呈上调表达趋势,说明toll通路中相关基因开始响应,以抵御环链虫草的侵染,同时发现Tu Myd88在响应过程中能够持续响应,在toll通路中发挥着重要作用。3、二斑叶螨几丁质酶基因、toll通路相关基因克隆及生物信息学分析根据二斑叶螨基因组数据筛选出Tu CHT12、Tu Myd88基因序列,利用RT–PCR技术,克隆获得c DNA序列,通过生物信息学分析了Tu CHT12、Tu Myd88基因编码的蛋白质的理化性质、序列分析和系统进化树。发现Tu CHT12开放阅读框（ORF）为1020 bp,编码339个氨基酸;预测CHT12蛋白的等电点和分子量分别为6.50和48.69k Da,具有一个信号肽,可能是一种分泌蛋白。通过氨基酸序列比对获得的进化树分析结果表明,Tu CHT12与Drosophila melanogaster CHT10聚在一个分支上,而Dm CHT10为II型几丁质酶,初步推测也Tu CHT12为II型几丁质酶,推测可能通过调节昆虫体内几丁质含量从而起到免疫防御作用;Tu Myd88开放阅读框为（ORF）1350 bp,编码449个氨基酸。预测Myd88蛋白的等电点和分子量分别为5.83和51.25 k Da。Tu Myd88与同为真螨目的Sarcoptes scabiei、Dermatophagoides pteronyssinus聚在同一支上关系较为亲近,相似度为80%。4、二斑叶螨Tu CHT12、Tu Myd88基因功能验证研究发现Tu CHT12基因沉默时Tu CHT11表达量也

关键词：环链虫草二斑叶螨保护酶解毒酶几丁质酶 toll通路

家蚕BmPGRP-S1与BmPGRP-S4功能的初步研究

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家蚕BmPGRP-S1与BmPGRP-S4功能的初步研究

作者：任美佳江苏大学

学位级别：硕士

昆虫在长期进化的过程中形成一套完整的免疫系统,即先天免疫系统,来抵御微生物的感染。昆虫的先天免疫主要依靠模式识别受体来识别病原菌的病原体相关分子模式,而这些病原体相关分子模式只存在于微生物而不存在宿主中,例如:脂多糖、肽... 详细信息

昆虫在长期进化的过程中形成一套完整的免疫系统,即先天免疫系统,来抵御微生物的感染。昆虫的先天免疫主要依靠模式识别受体来识别病原菌的病原体相关分子模式,而这些病原体相关分子模式只存在于微生物而不存在宿主中,例如:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸等。其中肽聚糖识别蛋白作为一种重要的模式识别受体能识别病原微生物细胞壁的主要成分肽聚糖。迄今为止,对于果蝇肽聚糖识别蛋白的研究较为透彻,而对于家蚕肽聚糖识别蛋白的研究较少。本论文主要对家蚕的肽聚糖识别蛋白,即BmPGRP-S1和BmPGRP-S4,进行了比较全面的研究,研究结果如下:1.运用生物信息学方法对BmPGRP-S1和BmPGRP-S4基因进行分析,确定这两种基因的序列号分别为NM-001043371,XM-004928822。分别编码196和199个氨基酸,且都有信号肽和一个保守的PGRP结构域,无跨膜结构域。通过序列比对和构建进化树分析,发现这两个基因在昆虫中是高度保守的。通过荧光定量PCR技术,对BmPGRP-S1和BmPGRP-S4在家蚕不同发育时期和组织器官中进行基因转录分析发现,BmPGRP-S1主要在5龄幼虫和脂肪体中表达,而BmPGRP-S4主要在家蚕早期幼虫和血淋巴中表达。2.利用HE染色技术对感染细菌的家蚕中肠组织进行研究。研究发现随着感染细菌时间的延长,其中肠组织逐渐发生病变,表现为细胞核增大并逐渐脱落,中肠组织发生断裂,直至中肠组织聚集成团,无完整细胞结构出现,最终导致家蚕死亡。利用免疫组化实验发现,在细菌感染下,BmPGRP-S1蛋白位于细胞质中,并均匀分布在整个肠腔。3.采用荧光定量PCR的方法研究基因在转录水平上的变化。通过实验发现,细菌感染家蚕后,诱导免疫相关基因(Imd和toll通路相关基因和抗菌肽基因)以及BmPGRP-S1和BmPGRP-S4的表达。BmPGRP-S1参与家蚕的先天免疫过程,并且在不同的组织中由细菌诱导其表达量明显不同;同时对于同一组织,由于对不同微生物的敏感性不同导致BmPGRP-S1的表达量也有所差异。BmPGRP-S4主要表达于血淋巴中以响应细菌的感染,但当家蚕感染大肠杆菌时,与感染其它细菌相比,BmPGRP-S4表达量无明显变化。4.采用双荧光素酶报告基因的方法,将5种抗菌肽基因启动子构建到PGL3载体上,通过测定荧光素酶活性来检测启动子活性。实验发现,BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白对抗菌肽的启动子具有激活作用,这表明BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白可以激活抗菌肽基因的表达。5.利用RNA干扰技术在家蚕蚕体和中肠组织中成功敲低BmPGRP-S1的表达,在血淋巴中成功敲低BmPGRP-S4的表达。结果表明,在家蚕蚕体和中肠组织中,对BmPGRP-S1进行RNA干扰后,CecA、Glv1、Leb3、Mor这4种抗菌肽基因的表达明显降低,同时参与Imd通路中的Dredd和FADD基因表达量的降低,而对于参与toll通路中的Myd88和Tube基因的表达量无影响。由此推测,在中肠组织中,BmPGRP-S1蛋白参与家蚕先天免疫中Imd通路的激活,并通过激活Imd通路产生抗菌肽,从而杀死入侵的细菌。在家蚕血淋巴组织中,对BmPGRP-S4进行RNA干扰后,导致CecA、Leb3、Mor这3种抗菌肽基因的表达明显增加,同时参与Imd通路中的FADD基因表达量的升高,而对于参与toll通路中的Pelle和Tube基因的表达量无影响。由此推测,BmPGRP-S4蛋白可能对Imd通路起抑制作用,并通过抑制Imd通路的激活抑制抗菌肽表达,从而防止Imd通路的过度激活以损害宿主。

关键词：家蚕肽聚糖识别蛋白先天免疫 Imd通路 toll通路