家蚕BmPGRP-S1与BmPGRP-S4功能的初步研究

作     者：任美佳 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王强

授予年度：2019年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：家蚕 肽聚糖识别蛋白 先天免疫 Imd通路 Toll通路 

摘      要：昆虫在长期进化的过程中形成一套完整的免疫系统,即先天免疫系统,来抵御微生物的感染。昆虫的先天免疫主要依靠模式识别受体来识别病原菌的病原体相关分子模式,而这些病原体相关分子模式只存在于微生物而不存在宿主中,例如:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸等。其中肽聚糖识别蛋白作为一种重要的模式识别受体能识别病原微生物细胞壁的主要成分肽聚糖。迄今为止,对于果蝇肽聚糖识别蛋白的研究较为透彻,而对于家蚕肽聚糖识别蛋白的研究较少。本论文主要对家蚕的肽聚糖识别蛋白,即BmPGRP-S1和BmPGRP-S4,进行了比较全面的研究,研究结果如下:1.运用生物信息学方法对BmPGRP-S1和BmPGRP-S4基因进行分析,确定这两种基因的序列号分别为NM-001043371,XM-004928822。分别编码196和199个氨基酸,且都有信号肽和一个保守的PGRP结构域,无跨膜结构域。通过序列比对和构建进化树分析,发现这两个基因在昆虫中是高度保守的。通过荧光定量PCR技术,对BmPGRP-S1和BmPGRP-S4在家蚕不同发育时期和组织器官中进行基因转录分析发现,BmPGRP-S1主要在5龄幼虫和脂肪体中表达,而BmPGRP-S4主要在家蚕早期幼虫和血淋巴中表达。2.利用HE染色技术对感染细菌的家蚕中肠组织进行研究。研究发现随着感染细菌时间的延长,其中肠组织逐渐发生病变,表现为细胞核增大并逐渐脱落,中肠组织发生断裂,直至中肠组织聚集成团,无完整细胞结构出现,最终导致家蚕死亡。利用免疫组化实验发现,在细菌感染下,BmPGRP-S1蛋白位于细胞质中,并均匀分布在整个肠腔。3.采用荧光定量PCR的方法研究基因在转录水平上的变化。通过实验发现,细菌感染家蚕后,诱导免疫相关基因(Imd和Toll通路相关基因和抗菌肽基因)以及BmPGRP-S1和BmPGRP-S4的表达。BmPGRP-S1参与家蚕的先天免疫过程,并且在不同的组织中由细菌诱导其表达量明显不同;同时对于同一组织,由于对不同微生物的敏感性不同导致BmPGRP-S1的表达量也有所差异。BmPGRP-S4主要表达于血淋巴中以响应细菌的感染,但当家蚕感染大肠杆菌时,与感染其它细菌相比,BmPGRP-S4表达量无明显变化。4.采用双荧光素酶报告基因的方法,将5种抗菌肽基因启动子构建到PGL3载体上,通过测定荧光素酶活性来检测启动子活性。实验发现,BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白对抗菌肽的启动子具有激活作用,这表明BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白可以激活抗菌肽基因的表达。5.利用RNA干扰技术在家蚕蚕体和中肠组织中成功敲低BmPGRP-S1的表达,在血淋巴中成功敲低BmPGRP-S4的表达。结果表明,在家蚕蚕体和中肠组织中,对BmPGRP-S1进行RNA干扰后,CecA、Glv1、Leb3、Mor这4种抗菌肽基因的表达明显降低,同时参与Imd通路中的Dredd和FADD基因表达量的降低,而对于参与Toll通路中的Myd88和Tube基因的表达量无影响。由此推测,在中肠组织中,BmPGRP-S1蛋白参与家蚕先天免疫中Imd通路的激活,并通过激活Imd通路产生抗菌肽,从而杀死入侵的细菌。在家蚕血淋巴组织中,对BmPGRP-S4进行RNA干扰后,导致CecA、Leb3、Mor这3种抗菌肽基因的表达明显增加,同时参与Imd通路中的FADD基因表达量的升高,而对于参与Toll通路中的Pelle和Tube基因的表达量无影响。由此推测,BmPGRP-S4蛋白可能对Imd通路起抑制作用,并通过抑制Imd通路的激活抑制抗菌肽表达,从而防止Imd通路的过度激活以损害宿主。