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Arctigen对LPS诱导的神经炎症和认知障碍的保护作用及机制研究

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Arctigen对LPS诱导的神经炎症和认知障碍的保护作用及机制研究

作者：董晓辉河南科技大学

学位级别：硕士

研究表明,牛蒡子苷元（arctigen,ARG）在人体内具有很强的抗炎作用。本研究通过构建神经炎症动物模型,旨在探讨ARG对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的神经炎症、神经生物学改变及认知功能障碍的保护作用及其可能机制。方法C57bL... 详细信息

研究表明,牛蒡子苷元（arctigen,ARG）在人体内具有很强的抗炎作用。本研究通过构建神经炎症动物模型,旨在探讨ARG对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的神经炎症、神经生物学改变及认知功能障碍的保护作用及其可能机制。方法C57bL/6J雄性小鼠（体重22±2g）随机分为野生对照（Control）组,模型组（LPS,250μg/kg/d）,牛蒡子苷元治疗组（ARG,100mg/kg/d）,治疗药物单用组（ARG,100mg/kg/d）。连续腹腔注射LPS（250μg/kg/d）7天构建神经炎症动物模型,溶解于0.5%羧甲基纤维素的ARG在腹腔注射LPS前两周按剂量进行灌胃治疗,持续3周。Control组腹腔注射相同容量的0.9%无菌生理盐水和灌胃0.5%羧甲基纤维素钠作为对照。治疗结束后,通过Morris水迷宫检测实验动物认知能力。尼氏（Nissl）染色结合海马组织凋亡相关分子Caspese3和PARP1的表达检测海马神经元损伤;硫磺素S（Thioflavine-S）染色结合免疫荧光染色检测Aβ二聚体以及Aβ表达,进一步通过免疫印迹检测APP、bACE1的表达分析Aβ的生成;免疫荧光SYP和PSD95共染检测突触密度;免疫组化检测海马组织CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,免疫印迹检测小胶质细胞标志物IbA1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达,通过ELISA分析脑组织炎症因子Tnf-α、IL-6以及IL-1β的含量;免疫印迹检测tlr4/CD14/nf-кb信号的表达。同时我们用LPS作用的脑特异性巨噬细胞bV2细胞系诱导神经炎症反应,用CCK8法检测细胞活性,筛选合适的ARG给药浓度,用ELISA法检测不同浓度的ARG对bV-2细胞释放炎症因子Tnf-α、IL-1β、IL-6的影响,进一步通过免疫荧光检测tlr4/CD14/nf-кb信号的激活,研究ARG的抗炎以及神经保护作用。结果Morris水迷宫平台隐藏实验结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠寻找隐藏平台的潜伏期显著延长;而与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠寻找隐藏平台的潜伏期显著缩短（均p＜0.05）。空间探索实验结果中,与Control组相比,LPS模型组小鼠在目标象限停留时间减少了31.4%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠在目标象限停留时间增加了30.7%。Nissl染色结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域尼氏小体分别降低41.5%、56.5%、58.4%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域尼氏小体分别增加34.1%、39.1%、35.9%。免疫印迹检测神经元损伤相关凋亡分子Caspese3和PARP1蛋白表达,发现与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织cleaved-capase3和cleaved-PARP1分别增加64%和48%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠海马组织c l e a v e d-c a p a s e 3和cleaved-PARP1分别减少31.8%和36.7%。Thioflavine-S染色和Aβ免疫荧光染色结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内Aβ二聚体和Aβ含量显著增加;与模型组相比,小鼠海马组织内Aβ二聚体和Aβ含量显著下降。免疫印迹检测APP与bACE1的含量,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织APP和bACE1分别增加74.5%和58.6%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内APP和bACE1分别减少30.4%和31.6%。免疫荧光共染结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内突触密度下降43%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内突触增加36.9%。免疫印迹结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内突触标记物SYP和PSD95的表达分别下降39%和41.9%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内突触标记物SYP和PSD95的表达分别增加28.5%和59.9%。免疫组化结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞含量分别增加36.5%、48.2%和51.5%,星形胶质细胞含量分别增加46.4%、51.9%和23.5%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞含量分别减少50.5%、46.3%和46.1%,星形胶质细胞含量分别减少41.7%、55.1%和39.6%。免疫印迹检测胶质细胞标记物结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织GFAP和IbA1含量增加,与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内GFAP和IbA1显著减少。ELLISA结果显示,与Contr

关键词：牛蒡子苷元认知脂多糖神经炎症 TLR4/NF-κB

紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠的防治作用及机制研究

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紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠的防治作用及机制研究

作者：吕兴大理大学

学位级别：硕士

目的:以紫地榆为研究对象,明确其活性部位,通过建立大鼠急性溃疡性结肠炎模型,观察紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理学改变、炎症因子变化、TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠发挥... 详细信息

目的:以紫地榆为研究对象,明确其活性部位,通过建立大鼠急性溃疡性结肠炎模型,观察紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理学改变、炎症因子变化、TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨紫地榆提取物对溃疡性结肠炎大鼠发挥防治作用的机制。方法:1、通过紫外可见分光光度法测定紫地榆乙醇总提物及其不同极性部位鞣质、黄酮、多糖及生物碱的含量。2、建立紫地榆乙醇总提物及其不同极性部位的HPLC图谱,采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法测定紫地榆不同部位的抗炎活性,采用双变量相关分析和偏最小二乘回归分析不同部位HPLC特征色谱峰与其抗炎药效之间的谱效关系。3、应用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导SD大鼠溃疡性结肠炎（UC）,采用自由饮用和灌胃两种给药方式建立急性UC模型,通过大鼠一般情况、疾病活动指数评分（DAI）、结肠长度、结肠组织大体评分、病理学评分来评价UC大鼠结肠组织形态和病理组织结果,生化检测法来检测UC大鼠血清中MPO活性,结肠组织中MDA含量、SOD、GSH-Px活力。4、采用DSS诱导大鼠急性UC模型,将48只大鼠随机分为正常组,模型组,紫地榆乙酸乙酯部位（EAEG）低、中、高剂量组和柳氮磺胺吡啶（SASP）组,每组8只,通过观察大鼠一般情况、疾病活动指数评分（DAI）、结肠长度、结肠组织大体评分、病理学评分、外周血细胞含量、酶联免疫法（ELISA）检测大鼠结肠组织中炎症因子（Tnf-α、IL-1β、IL-6、IL-10）含量来评价EAEG对UC大鼠的防治作用。5、采用DSS诱导大鼠急性UC模型,将48只大鼠随机分为正常组、模型组、EAEG剂量组（低、中、高）和柳氮磺胺吡啶（SASP）组,每组8只,采用生化检测法检测大鼠结肠组织中MDA含量和SOD、GSH-Px活力,RT-qPCR法检测TLR4/NF-κB信号通路中相关细胞因子tlr4、nf-κb p65、Tnf-α、IL-6及Inf-γmRNA表达水平,Nrf2/HO-1信号通路中Nrf2、HO-1 mRNA表达水平,Western blot法检测tlr4、P-nf-κb p65、nf-κb p65及IL-6蛋白表达水平,探讨紫地榆对UC大鼠发挥防治作用的机制。结果:1、紫地榆乙醇总提物及其不同极性部位均含有鞣质、黄酮、多糖及生物碱,其中乙酸乙酯部位鞣质含量较高（57.52%）,乙醇总提物黄酮含量较高（44.33%）,水部位多糖含量较高（78.48%）,氯仿部位生物碱含量较高（1.04%）。2、紫地榆不同部位均有抗炎作用,其中乙酸乙酯部位作用最佳。HPLC图谱所标定的27个特征色谱峰中,有13个与抗炎率呈显著相关,分别为1（没食子酸）、2（没食子酸甲酯）、3（儿茶素）、8、11、13、15、17、19（五没食子酰葡萄糖）、20、21、25、27号峰。3、两种给药方式均可建立UC模型,其中自由饮用组较正常组,DAI评分显著升高（P＜0.01）,结肠长度缩短（P＜0.05）,结肠组织大体评分和病理学评分显著升高（P＜0.01）,外周血细胞中WbC、RbC和LY细胞含量升高（P＜0.05）,血清中MPO活性显著升高（P＜0.01）,结肠组织中MDA含量升高（P＜0.05）,SOD、GSH-Px活力降低（P＜0.05）;较灌胃组结肠组织呈重度炎症的变化,DAI评分、结肠组织病理学评分、MPO活性、MDA含量、GSH-Px活力均具有明显差异（P＜0.05）,更符合Cooper造模标准。4、与正常组相比,模型组大鼠DAI评分显著升高（P＜0.01）,结肠长度显著缩短（P＜0.01）,结肠组织大体评分和病理学评分显著升高（P＜0.01）,外周血细胞中WbC、LY、GR含量均明显增加（P＜0.05）,血清中MPO活性显著升高（P＜0.01）,结肠组织中Tnf-α、IL-1β、IL-6含量均升高（P＜0.05）、IL-10含量降低（P＜0.01）,经药物干预后,各药物组各项指标均有不同程度的改善。5、与正常组相比,模型组大鼠TLR4/NF-κB信号通路中相关细胞因子tlr4、nf-κb p65、Tnf-α、IL-6和Inf-γmRNA表达水平显著升高（P＜0.01）,IL-10mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,tlr4、nf-κb p-p65/p65及IL-6蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,结肠组织中MDA含量升高（P＜0.05）,SOD、GSH-Px活力显著降低（P＜0.01）,Nrf2/HO-1信号通路中Nrf2、HO-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,经药物干预后,各药物组各项指标均有不同程度的改善。结论:1、该研究建立的含量测定方法简便准确,为紫地榆的综合质量评价奠定基础。2、紫地榆乙酸乙酯部位抗炎活性作用最强,可能是多个成分共同作用的结果。3、5%DSS自由饮用7 d诱导SD大鼠急性UC是一种较为理想的UC动物模型,与文献报道一致,可作为研究急

关键词：溃疡性结肠炎 TLR4/NF-κB Nrf2/HO-1 紫地榆葡聚糖硫酸钠

二草清肝汤抑制LPS引起肝损伤的tlr4及其下游信号分子表达

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浙江中医杂志 2022年第1期57卷 4-7页

作者：万苗欧阳钦吴春明刘三海赵安静浙江中医药大学附属温州中医院浙江温州325000

目的:研究二草清肝汤(EQD)对内毒素脂多糖(LPS)联合D-氨基半乳糖(D-GalN)致小鼠急性肝损伤模型的:Toll样受体4(tlr4)信号通路的作用。方法:将21只bALb/C小鼠随机分为四个组:空白对照组(n=3)、内毒素模型组(n=7),均给予氯化钠溶液灌胃(3m... 详细信息

目的:研究二草清肝汤(EQD)对内毒素脂多糖(LPS)联合D-氨基半乳糖(D-GalN)致小鼠急性肝损伤模型的:Toll样受体4(tlr4)信号通路的作用。方法:将21只bALb/C小鼠随机分为四个组:空白对照组(n=3)、内毒素模型组(n=7),均给予氯化钠溶液灌胃(3ml/kg);二草清肝汤小剂量组(n=6)、大剂量组(n=5)分别予生药含量为3.3g/ml、6.6g/ml的EQD溶液灌胃(3ml/kg)。每日1次,连续12天。最后一天灌胃4h后,除空白对照组外,其余组所有小鼠均腹腔注射LPS和D-GalN混合液造模,腹腔注射24h后,处死所有小鼠,剖取其肝脏称重、HE染色显微观察病理;各组小鼠tlr4、nf-κb表达情况,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法从RNA水平检测、Wb法从蛋白表达水平定量测定;tlr4蛋白表达应用免疫组化法。结果:内毒素性肝损伤小鼠肝重均较空白对照组低,加入二草清肝汤后小鼠肝重上升;病理结果显示空白组小鼠的肝小叶轮廓界限分明、清晰且完整,肝窦散布有序、较宽;肝上皮细胞排列规整、呈多边形;细胞质染色均匀、细胞核清晰、未见明显肿胀变性,库普弗细胞分布均匀,未见周部大量聚集。内毒素模型组中巨噬细胞聚集,肝小叶结构混乱、排列无序;肝细胞脂肪沉积、水肿明显较空白组严重;而二草清肝汤组病变则较前改善。免疫组化结果说明内毒素处理后的模型组中tlr4蛋白表达显著上升,加入大剂量二草清肝汤后tlr4稍有下降(Ptlr4、nf-κb mRNA表达下降,加入二草清肝汤后明显上升(Ptlr4信号通路的激活及相关炎症分子活化,改善LPS导致的肝损伤,其机制可能是EQD影响tlr4通路关键分子的蛋白翻译过程。

关键词：二草清肝汤 LPS TLR4/NF-κB 急性肝损伤小鼠

祛瘀消肿方对LPS刺激的巨噬细胞tlr4信号通路调控机制的研究

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浙江中西医结合杂志 2022年第12期32卷 1090-1095页

作者：金莉潘怡宏浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院湖滨院区中医科杭州310006

目的探讨祛瘀消肿方治疗乳腺炎的作用和可能调控机制。方法用含不同剂量(低、中、高)祛瘀消肿方血清预处理RAW264.7巨噬细胞,再进行脂多糖(LPS)刺激,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核检测细胞凋亡,同时实... 详细信息

目的探讨祛瘀消肿方治疗乳腺炎的作用和可能调控机制。方法用含不同剂量(低、中、高)祛瘀消肿方血清预处理RAW264.7巨噬细胞,再进行脂多糖(LPS)刺激,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核检测细胞凋亡,同时实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白[b细胞淋巴瘤-2蛋白(bcl2)和bcl2相关X蛋白(bax)]表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症细胞因子[肿瘤坏死因子-α(Tnf-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)]的水平。检测信号通路相关蛋白[Toll样受体4蛋白(tlr4)、核因子kappab蛋白(nf-κb-p65)、磷酸化nf-κb-p65蛋白(p-nf-κb-p65)、核因子κb抑制剂α蛋白(Iκb-α)和磷酸化Iκb-α蛋白(p-Iκb-α)]的变化。结果祛瘀消肿方可以增强LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活性[(36.32±4.32)%、(51.69±4.08)%、(74.33±4.92)%比(21.36±4.08)%,P均41.67±6.24)、(56.00±4.32)、(63.67±5.79)比(22.67±5.25),P均bax mRNA水平[(1.91±0.06)、(1.68±0.06)、(1.35±0.04)比(2.19±0.13),P均bcl2 mRNA水平[(0.46±0.05)、(0.62±0.04)、(0.87±0.05)比(0.22±0.07),P均nf-α:(1126.67±61.28)pg/mL、(873.33±55.58)pg/mL、(456.67±67.98)pg/mL比(1916.67±102.74)pg/mL;IL-1β:(67.67±5.56)pg/mL、(58.67±2.87)pg/mL、(35.33±4.49)pg/mL比(87.33±5.25)pg/mL;IL-6:(72.69±7.93)pg/mL、(55.36±3.68)pg/mL、(44.96±3.74)pg/mL比(96.33±4.18)pg/mL,P均tlr4、p-nf-κb-p65及p-Iκb-α表达;并使nf-κb-p65和Iκb-α表达增加。结论祛瘀消肿方通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用。

关键词：急性乳腺炎巨噬细胞 TLR4/NF-κB 祛瘀消肿方

胡黄连苦苷Ⅱ在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及机制

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临床心血管病杂志 2016年第9期32卷 952-956页

作者：张博方郭鑫陈静江洪武汉大学人民医院心血管内科武汉430060

目的:探讨胡黄连苦苷Ⅱ(picroside-Ⅱ,P-Ⅱ)对心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的保护作用及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:30只成年雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(SO组)、缺血再灌注组(I/R组)、胡黄连苦苷Ⅱ+缺... 详细信息

目的:探讨胡黄连苦苷Ⅱ(picroside-Ⅱ,P-Ⅱ)对心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的保护作用及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:30只成年雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(SO组)、缺血再灌注组(I/R组)、胡黄连苦苷Ⅱ+缺血再灌注组(P-Ⅱ+I/R组)。P-Ⅱ+I/R组术前30min给予胡黄连苦苷Ⅱ(25mg/kg)尾静脉注射。除SO组外,其余2组大鼠均行冠状动脉左前降支结扎30min再灌注4h,建立心肌I/R损伤模型;使用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的水平;HE染色观察心肌组织病理改变;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡并计算凋亡率;蛋白免疫印迹法检测tlr4、nf-κb及IL-6和Tnf-α的表达。结果:胡黄连苦苷Ⅱ预处理可显著降低LDH和CK的水平及心肌细胞凋亡率,差异有统计学意义(Ptlr4、nf-κb以及IL-6、Tnf-α蛋白表达水平均显著降低,差异有统计学意义(PTLR4/NF-κB炎症信号通路密切相关。

关键词：胡黄连苦苷Ⅱ 心肌缺血再灌注 TLR4/NF-κB 炎症反应

基于肠道菌群探讨参芪养心汤治疗扩张型心肌病的机制研究

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基于肠道菌群探讨参芪养心汤治疗扩张型心肌病的机制研究

作者：杨葛巍南京中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过动物实验,探讨DCM模型大鼠肠道菌群和正常大鼠是否存在差异性;探讨参芪养心汤能否通过改变扩张型心肌病大鼠肠道菌群的丰度及结构分布,进而影响DCM模型大鼠心肌组织中tlr-4/nf-κb mRNA的表达,达到改善DCM模型大鼠心功能、心... 详细信息

目的:通过动物实验,探讨DCM模型大鼠肠道菌群和正常大鼠是否存在差异性;探讨参芪养心汤能否通过改变扩张型心肌病大鼠肠道菌群的丰度及结构分布,进而影响DCM模型大鼠心肌组织中tlr-4/nf-κb mRNA的表达,达到改善DCM模型大鼠心功能、心肌损伤的治疗目标,为DCM的治疗提供新的切入点和研究方向。方法:45只雄性大鼠进行腹腔注射阿霉素构建DCM模型,8周后,评估模型是否成功,将造模成功大鼠随机分为模型组、美托洛尔组、参养心汤组、培哚普利组,另设正常组,治疗组每组每天分别根据体重给予相应药物,美托洛尔片50mg/kg(一天二次)、参芪养心汤1.87g/kg·d、培哚普利片3mg/kg·d,持续8周,干预期间,模型组和正常组予等体积生理盐水灌胃。实验结束后,各组大鼠麻醉后进行心脏彩超数据采集,包括左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩内径(LVESD)、短轴收缩率(FS)、左室射血分数(LVEF),禁食24小时后,麻醉、采血处死,ELISA测定血清脑钠尿肽(bNP)、肌钙蛋白I(cTnI);留取心脏组织,冷冻保存,采用RT-PCR法测定心肌组织中TOLL样受体4(tlr-4)、核因子κb(nf-κb)mRNA表达水平;留取扩张型心肌病模型组、参芪养心汤干预组及正常组的结肠粪便,进行16S扩增测序,观察三组间肠道菌群的差异性。结果:1.与正常组比较,模型组大鼠心脏彩超LVEDD、LVESD数值变大,LVEF、FS下降(各组数据比较PbNP、cTnI水平上升(各组数据比较PbNP、cTnI水平下降(各药物干预组数据与模型组比较Ptlr-4、nf-κb mRNA表达水平升高(各组数据比较Ptlr-4、nf-κb mRNA表达水平下降(各药物干预组数据与模型组比较P4.与正常组比较,模型组肠道菌群多样性上升,P0.05,差异不具有统计学意义;模型组肠道菌群,门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)、莫拉菌门(Moraxellaceae)显著下降,疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)显著富集;属水平上,模型组肠道菌群 Lactobacillus、Ruminiclostridium6、Anaerofilum、Roseburia、Psychrobacter、Odribacter、Eubacteriumxylanophilumgroup显著下降,而模型组在 Romboustia、Eubacteriumcoprostanoligenes、Clostridiumsensustricto1、Pasteurella、bifidobacterium、Dorea、Adlercreutzia、Faecalibaculum 等属的富集。5.与模型组比较,参芪养心汤组,菌群多样性和均匀度均上升,Pbacteria)显著下降,而拟杆菌门(bacteroidates)表现为富集;属水平上,参芪养心汤组在Romboustia、Eubacteriumcoprostanoligenes、Clostridiumsensustricto1、Pasteurella、bifidobacterium、Dorea、Adlercreutzia、Faecalibaculum 等属显著下降,在Oscillibacter、Ruminiclostridium9、Oscillibacter、Ruminiclostridium、Anaerovorax、Tyzzerella、Ruminclostridium、Intestinimonas 等属有显著富集。6.在属水平与tlr-4 mRNA表达水平呈正相关的有blautia、Lactococcus、Romboutsia、Ruminococcaceae UCG-013、[Eubacterium]Coprostanoligenesgroup、LachnospiraceaeUCG-006、Pasteurellla;与 nf-κb mRNA 表达水平呈正相关的有Akkermansia、LachnospiraceaeUCG-006、Pasteurella、Turicib

关键词：扩张型心肌病参芪养心汤肠道菌群 TLR4/NF-κB

胡椒碱对炎症引起的高产蛋鸡减产效应的防御作用

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胡椒碱对炎症引起的高产蛋鸡减产效应的防御作用

作者：杨舒婷浙江大学

学位级别：硕士

炎症是机体对于外界刺激的一种自发性的免疫反应,造成炎症的因素有很多,包括生物性因子、物理性因子、化学性因子、异物、坏死组织及变态反应。革兰氏阴性菌属于生物性因子,在自然界中分布广泛。禽类养殖业中,环境、水、饲喂的饲料甚至... 详细信息

炎症是机体对于外界刺激的一种自发性的免疫反应,造成炎症的因素有很多,包括生物性因子、物理性因子、化学性因子、异物、坏死组织及变态反应。革兰氏阴性菌属于生物性因子,在自然界中分布广泛。禽类养殖业中,环境、水、饲喂的饲料甚至是空气中都存在革兰氏阴性菌,而其细胞壁中的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）则是诱导炎症的主要成分。炎症对生殖系统具有负面影响,其中包括对卵泡的形成、卵泡周期及排卵、黄体形成和妊娠维持。胡椒碱（Piperine）作为一种天然植物提取物,具有较强的抗炎作用。因此,本实验以海兰白鸡作为实验研究对象,研究胡椒碱和LPS对高产蛋鸡生产性能的影响,内容包括:第一部分研究体内胡椒碱对于炎症导致的卵巢损伤及卵泡发育异常的保护作用,第二部分研究体内胡椒碱对于炎症导致的肠道吸收功能损伤及钙代谢异常的缓解作用,第三部分建立体外培养模型研究胡椒碱对LPS诱导炎症导致的卵泡损伤的保护作用及相关机理,为将胡椒碱作为抗炎添加剂添加到饲料中以保障蛋鸡产蛋性能、提高其饲养价值和经济收益水平提供理论支撑。1.胡椒碱对炎症引起的高产蛋鸡产蛋性能下降的保护作用本实验以产蛋高峰期海兰白鸡作为实验动物。首先,建立体内炎症模型以研究LPS诱导的炎症对产蛋高峰期海兰白鸡卵巢造成的损伤。本实验选取不同剂量LPS（0、0.25、0.5、1 mg/kg bW）处理产蛋高峰期鸡,进行翅静脉注射,注射体积为1 mL/羽,处理时间为24 h。结果显示,0.5 mg/kg bW LPS处理会导致卵巢形态发生变性,卵泡发生皱缩,呈胶冻状变性,卵泡数量减少,闭锁卵泡数量增多。小白卵泡（Small white follicle,SWF）组织形态学变化显示,颗粒层颗粒细胞排布松散。在日常饲料中加入适宜剂量的胡椒碱（10 mg/kg bW）,连续饲喂21 d后用LPS处理,可抑制LPS造成的卵巢损伤。单独饲喂胡椒碱组卵巢形态未表现出与对照组之间有明显差异。统计发现,胡椒碱可缓解LPS造成的卵泡闭锁数量增多。免疫组化染色结果显示,胡椒碱可对LPS造成的卵泡中细胞增殖水平的降低起到保护作用。TUNEL染色结果显示,胡椒碱可抑制LPS造成的卵泡中细胞凋亡水平的升高。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基因（PCNA、CCND1和CDK2）与凋亡相关基因（Caspase-3、bAX和bcl2）的异常表达。此外,胡椒碱还可通过抑制促炎因子Tnf-α、IL-1β和IL-8的表达,提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达来缓解炎症的发生。通过对体内血清中雌二醇（E2）和孕酮（P4）的测定,发现胡椒碱也可促进E2和P4的释放。以上实验结果证明,胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡卵巢损伤具有保护作用。2.胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡肠道损伤及对钙代谢影响的保护作用通过以上建立的炎症模型,对肠道的损伤和钙代谢影响进行进一步的研究。结果显示,LPS处理会导致鸡发生腹泻、产软壳蛋等现象,鸡肝脏也出现出血点。肠道表观形态发生改变,十二指肠肠道弹性、韧性减弱,肠道皱褶不明显,肠道内部呈现肉眼可见血丝。而胡椒碱可缓解LPS诱导的炎症造成的肠道损伤和钙代谢异常。具体表现为,在HE染色切片中,可以观察到,肠道组织化学形态异常,黏膜层细胞密度降低,细胞水肿后发生破裂的情况得到缓解。在免疫组织化学染色切片中,可以观察到胡椒碱可缓解LPS诱导炎症造成的肠绒毛隐窝细胞增殖减少,细胞凋亡增多的现象。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基因（PCNA、CCND1和CDK2）与凋亡相关基因（Caspase-3、bAX和bcl2）的异常表达,可通过抑制促炎因子Tnf-α、IL-1β和IL-8的表达,提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达来缓解炎症的发生。本实验通过对肠道和子宫部中钙代谢相关基因（CALb1、CA2、OPN、OVO、OVA、OC-17-、OC-116和CLU）的检测,发现胡椒碱可将钙代谢相关基因维持在正常水平。本实验通过对产蛋情况的观察,发现胡椒碱可使蛋保持正常状态,拥有正常的蛋壳。以上实验结果证明,胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡肠道损伤及对钙代谢影响具有保护作用。3.胡椒碱通过抑制TRL4/nf-Kb信号通路的表达缓解炎症导致的炎症因子的水平变化为了能够更进一步地探究胡椒碱对LPS诱导炎症造成蛋鸡卵巢损伤的保护作用及其相关机理,本实验建立了体外培养模型。体外培养实验显示,LPS对卵泡发育的影响与体内相似,其中LPS的适宜浓度为50 μg/mL,而培养液中添加胡椒碱浓度为25μg/mL,对SWF发育的损伤起到保护作用。brdU结果显示,胡椒碱可缓解LPS对细胞增殖的抑制作用,提高细胞增殖水平。TUNEL结果显示,胡椒碱可抑制LPS诱导的体外培养SWF颗粒细胞凋亡水平上升,将细胞凋亡水平降低到对照组水平。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基

关键词：脂多糖胡椒碱炎症炎症因子 TLR4/NF-κB 蛋鸡

人参皂苷Rd对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究

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人参皂苷Rd对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究

作者：陈勇强吉林大学

学位级别：硕士

急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种以呼吸困难、呼吸功增加、肺内炎性细胞浸润、肺微血管通透性增高、肺泡和肺实质严重水肿及进行性低氧血症为特征的临床综合征,严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distres... 详细信息

急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种以呼吸困难、呼吸功增加、肺内炎性细胞浸润、肺微血管通透性增高、肺泡和肺实质严重水肿及进行性低氧血症为特征的临床综合征,严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）。ALI的总体死亡率高达40%,是危害人类健康的一项重大疾病。ALI的发病机制复杂,尚未完全被阐明,但随着失控炎症反应导致多器官功能障碍综合征这一新理论的出现,人们开始将注意力转向炎症损伤机制及其与ALI的关系。已有许多研究表明,一些抗炎、抗氧化与抗凋亡药物对ALI具有潜在治疗作用,能够减轻ALI导致的水肿、炎症反应等。目前对ALI的临床治疗以机械通气和液体管理为主,仍缺乏有效的药物治疗。因此,寻找防治ALI的有效药物具有重大意义。人参皂苷Rd（Ginsenoside Rd,G-Rd）属于20（S）-原人参二醇型（PPD）,主要存在于人参、三七中。研究表明,G-Rd与G-Rb1、G-Rg3等相比具有更强的抗炎、抗氧化及抗凋亡效应,但其对ALI是否具有保护作用及其机制尚未见文献报道。目的:观察G-Rd对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的ALI的保护作用,并初步探讨其作用的机制。方法:balb/c小鼠,雄性,随机分为空白对照组（Control）、模型组（Model）、G-Rd低、高剂量组和阳性药地塞米松（Dex）组。各组分别腹腔注射（ip）丙二醇-生理盐水溶液,G-Rd 10、20 mg/kg和Dex 5 mg/kg,给药体积为20 m L/kg。给药1 h后,各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉,待小鼠麻醉后将其固定于手术台,切开颈部皮肤暴露气管,使用微量玻璃注射器气管滴注。除Control组外其余各组小鼠均气管滴注20μg LPS,Control组气管滴注等体积的PbS作为对照,滴注后,将小鼠头朝上,轻轻旋转使滴入的液体均匀分布在小鼠肺部,缝合皮肤切口。造模24 h后,麻醉小鼠,取肺泡灌洗液（bLAF）检测巨噬细胞数、中性粒细胞数及炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-18和Tnf-α）含量;取肺组织,观察组织病理学改变,检测湿干比（W/D）、MPO活性、炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-18和Tnf-α）含量及NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。结果:1.与Control组比较,Model组小鼠肺组织W/D明显升高（P＜0.01）;与Model组比较,G-Rd 20 mg/kg及Dex 5 mg/kg组均能明显减少小鼠肺组织W/D（P＜0.05或P＜0.01）,G-Rd 10 mg/kg组小鼠肺组织W/D有下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。2.HE染色结果显示:Control组肺组织形态正常,肺泡结构完整,肺泡间隔均匀,肺泡壁薄且结构清晰,无出血或炎性细胞浸润;Model组肺组织中出现肺泡部分塌陷或膨胀不良,肺泡壁和间隔明显增厚,大量炎性细胞浸润,损伤明显;G-Rd 10、20 mg/kg组较Model组轻,炎性细胞浸润及红细胞渗出较少,G-Rd 20mg/kg组肺部病理改善效果优于G-Rd 10 mg/kg组;Dex 5mg/kg组肺组织形态正常,肺泡结构完整,肺泡间隔均匀,肺泡壁薄且结构清晰,无出血或炎性细胞浸润,与Control组相当。3.与Control组比较,Model组小鼠bLAF中巨噬细胞数、中性粒细胞数均显著增加（P＜0.01）;与Model组比较,G-Rd 20 mg/kg、Dex 5 mg/kg组巨噬细胞数及中性粒细胞数均显著下降（P＜0.01）,G-Rd 10 mg/kg组bLAF中巨噬细胞数、中性粒细胞数有下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。4.与Control组比较,Model组bLAF中Tnf-α、IL-1β、IL-6及IL-18含量均显著升高（P＜0.01）;与Model组比较,G-Rd 20 mg/kg、Dex 5 mg/kg组均能显著降低bLAF中Tnf-α、IL-1β、IL-6及IL-18含量（P＜0.05或P＜0.01）,G-Rd10 mg/kg组能显著降低bLAF中Tnf-α含量（P＜0.05）,IL-1β、IL-6及IL-18含量有降低趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。5.与Control组比较,Model组肺组织中MPO活性显著升高（P＜0.01）;与Model组比较,G-Rd 20 mg/kg、Dex 5 mg/kg均能显著降低小鼠肺组织中MPO活性（P＜0.01）,G-Rd 10 mg/kg组小鼠肺组织中MPO活性有降低趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。6.与Control组比较,Model组肺组织中Tnf-α、IL-1β、IL-6及IL-18含量均显著升高（P＜0.01）;与Model组比较,G-Rd 20 m

关键词：急性肺损伤脂多糖人参皂苷Rd TLR4/NF-κB NLRP3炎性小体

诺氟沙星固体脂质纳米粒治疗脓毒症的药理作用及机制研究

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诺氟沙星固体脂质纳米粒治疗脓毒症的药理作用及机制研究

作者：叶龙平海南医学院

学位级别：硕士

目的:设计合成一种诺氟沙星固体脂质纳米粒（Norf-SLN）,并探讨其体外缓释抑菌作用以及对脓毒症大鼠的保护作用及相关作用机制,为传统抗菌药物的修饰及临床上新型抗菌药物的开发提供一种可能的方法。方法:1.诺氟沙星固体脂质纳米粒的合... 详细信息

目的:设计合成一种诺氟沙星固体脂质纳米粒（Norf-SLN）,并探讨其体外缓释抑菌作用以及对脓毒症大鼠的保护作用及相关作用机制,为传统抗菌药物的修饰及临床上新型抗菌药物的开发提供一种可能的方法。方法:1.诺氟沙星固体脂质纳米粒的合成:采用超声高压均质法合成一种生物相容性好、具有缓释作用的Norf-SLN,并用多种方法进行表征。2.细胞毒性研究:配制不同浓度梯度的Norf-SLN溶液,通过将不同浓度Norf-SLN溶液加入CCK-8试剂,检测不同浓度Norf-SLN对RAW264.7细胞活性的影响。3.体外抗菌实验:采用微量肉汤稀释法,测量Norf-SLN溶液对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎链球菌ATCCC49619、铜绿假单胞菌ATCC27853这4种菌种的最小抑菌浓度（MIC）。研究诺氟沙星单体和Norf-SLN对细菌的时间杀伤效应。在肉汤中选择指数生长阶段的细菌,然后暴露在相同浓度（以所含诺氟沙星量为准）的氟沙星溶液和Norf-SLN溶液中。在37℃下孵育1、2、3和4 h后,在琼脂板中测定其细菌计数。4.脓毒症模型实验:采用盲肠结扎穿刺法（CLP）制备动物体内脓毒症模型,将wister大鼠随机分为模型组、空白组、假手术组、Norf-SLN高剂量组6.0 mg/kg（理论上含诺氟沙星6.0 mg/kg）、Norf-SLN中剂量组3.0 mg/kg（理论上含诺氟沙星3.0 mg/kg）、Norf-SLN低剂量组1.5 mg/kg（理论上含诺氟沙星1.5 mg/kg）、诺氟沙星阳性对照组3.0 mg/kg。成功制造脓毒症大鼠模型后,连续3天在相同的时间点给药。处死大鼠的方法为腹主动脉采血法。计算实验大鼠的72 h生存率。用Norf-SLN治疗后72 h后,用ELISA检测实验大鼠血清中的Tnf-α、IL-6的含量,实验大鼠血清中的AST、ALT、bUN、Cr用全自动血液生化分析仪检测,肝脏、肺部、肾脏的病理损伤情况用HE染色观察,实验大鼠tlr4、nf-κbp65蛋白的表达情况用Western blot检测,tlr4、nf-κbp65基因表达情况用q PCR法检测。结果:1.诺氟沙星固体脂质纳米粒的合成:成功制备了Norf-SLN纳米材料,TEM粒径为（150.1±5.3）nm,水合粒径为（224.1±3.6）nm,多分散指数（PDI）值为0.139±0.010,Zeta电位为（-40.2±2.3）m V。表征结果说明,制备的Norf-SLN纳米材料粒径均匀、分散性好、稳定性好。2.细胞毒性研究:通过不同浓度Norf-SLN对RAW 264.7的细胞毒性研究发现,Norf-SLN对RAW 264.7的细胞毒性,在一定药物浓度范围内,Norf-SLN药物浓度越大,RAW 264.7的细胞活性越低,反之亦然。3.体外抗菌实验:Norf-SLN对不同实验菌种测得的MIC也不同,其中对大肠埃希菌的MIC最小,抑菌作用最好。时间杀灭实验结果表明,在相同药物浓度下,Norf-SLN与Norf相比,CFU显著降低;固体脂质纳米粒修饰的诺氟沙星,体外抗菌活性,以时间依赖性为考察,优于未经修饰的诺氟沙星脂质体,与MIC结果一致。同时也证明Norf-SLN具有良好的缓释性。4.脓毒症模型实验:研究发现在大鼠盲肠结扎和穿刺模型（CLP）中,在含有相同诺氟沙星药物量的情况下,与未经修饰的诺氟沙星相比,经过固体脂质纳米粒修饰的诺氟沙星可以显著改善大鼠CLP后72 h病死率,血清中炎症因子Tnf-α、IL-6表达水平显著降低,肝脏、肾脏损伤的生化指标明显降低,从肝脏、肺部、肾脏的HE染色中可以观察到肝脏、肺部、肾脏的病理损伤显著减轻。另外,Western blot及q PCR结果提示,经固体脂质纳米粒修饰后的诺氟沙星,在含药量相同的情况下,可减弱tlr4、nf-κbp65基因的表达,减少tlr4、nf-κbp65蛋白的生成,通过此途径来减轻脓毒症大鼠的炎症反应。结论:Norf-SLN具有良好的缓释性,体外可以增效抑菌;其可能通过抑菌以及抑制炎症反应治疗脓毒症体内大鼠模型,且在含药量相等的情况下,Norf-SLN的治疗效果要优于未经固体脂质纳米粒子修饰的诺氟沙星。其可能的机制是通过干预、调节tlr-4/nf-κb信号通路实现减轻脓毒症大鼠的炎症反应。

关键词：脓毒症诺氟沙星固体脂质纳米抑菌炎症反应 TLR4/NF-κB