胡椒碱对炎症引起的高产蛋鸡减产效应的防御作用

作     者：杨舒婷 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张才乔

授予年度：2021年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：脂多糖 胡椒碱 炎症 炎症因子 TLR4/NF-κB 蛋鸡 

摘      要：炎症是机体对于外界刺激的一种自发性的免疫反应,造成炎症的因素有很多,包括生物性因子、物理性因子、化学性因子、异物、坏死组织及变态反应。革兰氏阴性菌属于生物性因子,在自然界中分布广泛。禽类养殖业中,环境、水、饲喂的饲料甚至是空气中都存在革兰氏阴性菌,而其细胞壁中的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）则是诱导炎症的主要成分。炎症对生殖系统具有负面影响,其中包括对卵泡的形成、卵泡周期及排卵、黄体形成和妊娠维持。胡椒碱（Piperine）作为一种天然植物提取物,具有较强的抗炎作用。因此,本实验以海兰白鸡作为实验研究对象,研究胡椒碱和LPS对高产蛋鸡生产性能的影响,内容包括:第一部分研究体内胡椒碱对于炎症导致的卵巢损伤及卵泡发育异常的保护作用,第二部分研究体内胡椒碱对于炎症导致的肠道吸收功能损伤及钙代谢异常的缓解作用,第三部分建立体外培养模型研究胡椒碱对LPS诱导炎症导致的卵泡损伤的保护作用及相关机理,为将胡椒碱作为抗炎添加剂添加到饲料中以保障蛋鸡产蛋性能、提高其饲养价值和经济收益水平提供理论支撑。1.胡椒碱对炎症引起的高产蛋鸡产蛋性能下降的保护作用本实验以产蛋高峰期海兰白鸡作为实验动物。首先,建立体内炎症模型以研究LPS诱导的炎症对产蛋高峰期海兰白鸡卵巢造成的损伤。本实验选取不同剂量LPS（0、0.25、0.5、1 mg/kg BW）处理产蛋高峰期鸡,进行翅静脉注射,注射体积为1 mL/羽,处理时间为24 h。结果显示,0.5 mg/kg BW LPS处理会导致卵巢形态发生变性,卵泡发生皱缩,呈胶冻状变性,卵泡数量减少,闭锁卵泡数量增多。小白卵泡（Small white follicle,SWF）组织形态学变化显示,颗粒层颗粒细胞排布松散。在日常饲料中加入适宜剂量的胡椒碱（10 mg/kg BW）,连续饲喂21 d后用LPS处理,可抑制LPS造成的卵巢损伤。单独饲喂胡椒碱组卵巢形态未表现出与对照组之间有明显差异。统计发现,胡椒碱可缓解LPS造成的卵泡闭锁数量增多。免疫组化染色结果显示,胡椒碱可对LPS造成的卵泡中细胞增殖水平的降低起到保护作用。TUNEL染色结果显示,胡椒碱可抑制LPS造成的卵泡中细胞凋亡水平的升高。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基因（PCNA、CCND1和CDK2）与凋亡相关基因（Caspase-3、BAX和Bcl2）的异常表达。此外,胡椒碱还可通过抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达,提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达来缓解炎症的发生。通过对体内血清中雌二醇（E2）和孕酮（P4）的测定,发现胡椒碱也可促进E2和P4的释放。以上实验结果证明,胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡卵巢损伤具有保护作用。2.胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡肠道损伤及对钙代谢影响的保护作用通过以上建立的炎症模型,对肠道的损伤和钙代谢影响进行进一步的研究。结果显示,LPS处理会导致鸡发生腹泻、产软壳蛋等现象,鸡肝脏也出现出血点。肠道表观形态发生改变,十二指肠肠道弹性、韧性减弱,肠道皱褶不明显,肠道内部呈现肉眼可见血丝。而胡椒碱可缓解LPS诱导的炎症造成的肠道损伤和钙代谢异常。具体表现为,在HE染色切片中,可以观察到,肠道组织化学形态异常,黏膜层细胞密度降低,细胞水肿后发生破裂的情况得到缓解。在免疫组织化学染色切片中,可以观察到胡椒碱可缓解LPS诱导炎症造成的肠绒毛隐窝细胞增殖减少,细胞凋亡增多的现象。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基因（PCNA、CCND1和CDK2）与凋亡相关基因（Caspase-3、BAX和Bcl2）的异常表达,可通过抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达,提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达来缓解炎症的发生。本实验通过对肠道和子宫部中钙代谢相关基因（CALB1、CA2、OPN、OVO、OVA、OC-17-、OC-116和CLU）的检测,发现胡椒碱可将钙代谢相关基因维持在正常水平。本实验通过对产蛋情况的观察,发现胡椒碱可使蛋保持正常状态,拥有正常的蛋壳。以上实验结果证明,胡椒碱对LPS诱导的蛋鸡肠道损伤及对钙代谢影响具有保护作用。3.胡椒碱通过抑制TRL4/NF-KB信号通路的表达缓解炎症导致的炎症因子的水平变化为了能够更进一步地探究胡椒碱对LPS诱导炎症造成蛋鸡卵巢损伤的保护作用及其相关机理,本实验建立了体外培养模型。体外培养实验显示,LPS对卵泡发育的影响与体内相似,其中LPS的适宜浓度为50 μg/mL,而培养液中添加胡椒碱浓度为25μg/mL,对SWF发育的损伤起到保护作用。BrdU结果显示,胡椒碱可缓解LPS对细胞增殖的抑制作用,提高细胞增殖水平。TUNEL结果显示,胡椒碱可抑制LPS诱导的体外培养SWF颗粒细胞凋亡水平上升,将细胞凋亡水平降低到对照组水平。荧光定量PCR结果显示,胡椒碱可缓解LPS诱导的体内增殖相关基因（PCNA、CCND1和CDK2）与凋亡相关基因（Caspase-3、BAX和Bcl2）的异常表达,可通过抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达,提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达。对TLR4/NF-κB信号通路的表达水平进行检测,结果显示,胡椒碱可抑制LPS诱导的TLR4、NF-κB基因表达水平上调,并且将其恢复到对照组水平。以上结果证明,胡椒碱可通过抑制TLR4/NF-κB的信号转录途径,发挥抗炎作用,从而保护卵泡的细胞增殖水平,抑制细胞凋亡增加,保护卵泡的形态结构和功能。综上所述,本文建立了用LPS诱导的体内炎症模型。实验结果显示,LPS诱导炎症能够造成高产蛋鸡卵巢、肠道损伤,造成蛋鸡生产性能下降。而胡椒碱能够对炎症起到预防作用,这种作用体现在维持卵泡正常发育,保障E2和P4正常分泌,维持卵泡和肠道中的细胞增殖-凋亡的平衡,调控炎性因子的正常表达,调控肠道内钙代谢和子宫内钙沉积相关基因的表达,防御炎症造成的减产效应。而对TRL4/NF-κB信号通路的研究表明,胡椒碱对TRL4/NF-κB信号通路的抑制参与了其抗炎作用。