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粉虱传双生病毒的tas-elisa及PCR快速检测

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植物病理学报 2002年第2期32卷 182-186页

作者：谢艳张仲凯李正和丁铭周雪平浙江大学生物技术研究所杭州310029 云南省农科院生物技术研究所昆明650223

利用粉虱传双生病毒 (WTGs)多克隆抗体及单克隆抗体 ,建立了三抗体夹心 EL ISA (tas-EL ISA)检测 WTGs的方法 ,并发现了单克隆抗体 SCR18可广泛用于我国 WTGs的检测。利用根据WTGs基因组上基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的引物 ... 详细信息

利用粉虱传双生病毒 (WTGs)多克隆抗体及单克隆抗体 ,建立了三抗体夹心 EL ISA (tas-EL ISA)检测 WTGs的方法 ,并发现了单克隆抗体 SCR18可广泛用于我国 WTGs的检测。利用根据WTGs基因组上基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的引物 ,建立了 PCR特异检测 WTGs的方法。对田间病样的 tas- EL ISA和 PCR检测表明 ,粉虱传双生病毒在云南省烟草、番茄和南瓜上均存在 ,2种方法的测定结果是一致的。

关键词：植物病毒传播粉虱传双生病毒 tas-elisa PCR 快速检测

单抗I-elisa和tas-elisa检测百合无症病毒的研究

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植物病理学报 2006年第4期36卷 301-305页

作者：刘成科吴建祥洪健周雪平叶美琴浙江大学生物技术研究所杭州310029 浙江省丽水市农业局丽水323000

以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接elisa(I-elisa)和三抗体夹心elisa(tas-elisa)的检测方法。I-elisa检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶20和1∶6 000,对病叶汁液的检... 详细信息

以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接elisa(I-elisa)和三抗体夹心elisa(tas-elisa)的检测方法。I-elisa检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶20和1∶6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1∶2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。tas-elisa检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶200和1∶6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1∶5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agd ia公司双抗体夹心elisa(DAS-elisa)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1∶2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种elisa方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-elisa、tas-elisa和DAS-elisa测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,tas-elisa的灵敏度高于DAS-elisa和I-elisa。相同样品I-elisa所测出的OD405值和P/N值普遍高于DAS-elisa,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。

关键词：百合无症病毒 I-elisa tas-elisa DAS-elisa

Monoclonal Antibodies Against the Whitefly-Transmitted Tomato Yellow Leaf Curl Virus and Their Application in Virus Detection

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Journal of Integrative Agriculture 2012年第2期11卷 263-268页

作者： WU Jian-xiang SHANG Hai-li XIE Yan SHEN Qing-tang ZHOU Xue-ping Institute of Biotechnology Zhejiang UniversityHangzhou 310029P.R.China

Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）is a species of the family Geminiviridae,causing serious yield losses in tomato *** coat protein（CP）gene of TYLCV isolate SH2 was expressed in Escherichia coli BL21（DE3）using pET-32a as the expression *** recombinant protein was purified through Ni＋-NTA affinity column and used to immunize BALB/c *** hybridoma cell lines（2B2,2E3 and 3E10）secreting monoclonal antibodies（MAbs）against TYLCV CP were obtained by fusing mouse myeloma cells（Sp 2/0）with spleen cells from the immunized BALB/c *** titers of ascitic fluids of three MAbs ranged from 10-6 to 10-7 in *** and subclasses of all the MAbs belonged to IgG1,κ light *** antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（tas-elisa）showed that the MAb 3E10 could react with five begomoviruses infecting tomato,while the other two（2B2 and 2E3）mainly reacted with ***-elisa was set up using the MAb 3E10,and the established method could successfully detect virus in plant sap at 1：2 560（w/v,g mL-1）.Detection of field samples showed that begomoviruses were common in tomato crops in Zhejiang Province,China.

关键词： Tomato yellow leaf curl virus coat protein monoclonal antibody tas-elisa

Monoclonal antibody-based serological methods for detecting Citrus tristeza virus in citrus groves

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Virologica Sinica 2016年第4期31卷 324-330页

作者： Zhen Liu Zhe Chen Jian Hong Xuefeng Wang Changyong Zhou Xueping Zhou Jianxiang Wu State Key Laboratory of Rice Biology Institute of BiotechnologyZhejiang University China Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences Southwest University

Citrus tristeza virus （CTV） is one of the most economically important citrus viruses and harms the citrus industry worldwide. To develop reliable and effective serological detection assays of CTV, the major capsid protein （CP） gene of CTV was expressed in Escherichia coli BL21 （DE3） using the expression vector pET-28a and purified through Ni＊-NTA affinity chromatography. The recombinant protein was used to immunize BALB/c mice. Four hybridoma cell lines （14B10, 14Hll, 20D5, and 20G12） secreting monoclonal antibodies （MAbs） against CTV were obtained through conventional hybridoma technology. The titers of MAb-containing ascitic fluids secreted by the four hybridoma lines ranged from 10-6 to 10.7 in indirect enzyme-linked immunosorbent assay （elisa）. Western blots showed that all four MAbs could specifically react with CTV CP. Using the prepared MAbs, dot-elisa, Tissue print-elisa, and triple antibody sandwich （tas）-elisa were developed to detect CTV in tree nurseries and epidemiological studies. The developed dot-elisa and tas-elisa methods could detect CTV in crude extracts of infected citrus leaves with dilutions of 1：2560 and 1：10, 240 （w/v, g/mL）, respectively. Tissue print-elisa was particularly useful for large-scale field sample detection, mainly owing to its simplicity and lack of sample preparation requirements. The field survey revealed that CTV is prevalent on citrus trees in the Chongqing Municipality, Jiangxi Province, and Zhejiang Province of China. The coincidence rate of serological and RT-PCR test results reached more than 99.5%. The prepared MAbs against CTV and established sensitive and specific serological assays have a significant role in the detection and prevention and control of CTV in our country.

关键词： Citrus tristeza virus (CTV) monoclonal antibody dot-elisa Tissue print-elisa tas-elisa

浙江宁波雪里蕻花叶病病原鉴定及雪里蕻品种的抗病性测定

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植物病理学报 2006年第5期36卷 413-419页

作者：施曼玲周雪平浙江大学生物技术研究所

从浙江宁波雪里蕻上获得97株呈花叶症状的病毒样品,利用三抗体夹心酶联免疫吸附测定(tas-elisa)在97株雪里蕻花叶样品中均检测到芜菁花叶病毒(Turnip m osaic virus,TuMV),所有的样品都没有检测到黄瓜花叶病毒(Cu-cum berm osaic virus,... 详细信息

从浙江宁波雪里蕻上获得97株呈花叶症状的病毒样品,利用三抗体夹心酶联免疫吸附测定(tas-elisa)在97株雪里蕻花叶样品中均检测到芜菁花叶病毒(Turnip m osaic virus,TuMV),所有的样品都没有检测到黄瓜花叶病毒(Cu-cum berm osaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(Tobacco m osaic virus,TMV);利用免疫捕捉反转录PCR(IC-RT-PCR)对部分TuMV样品中的CP和HC-Pro基因进行了扩增,所有样品都得到约0.8kb和1.4kb的2条特异条带,因此宁波雪里蕻花叶病的主要病原是TuMV。对53个雪里蕻栽培品种在温室和大田进行了人工接种,共鉴定出抗病品种7个,耐病品种22个,感病品种24个,未发现高抗品种。总的来说,细叶型品种比花叶型和板叶型品种抗病。利用tas-elisa方法对接种的53个雪里蕻品种中的TuMV浓度进行测定,在接种后10、15、20和30d,TuMV检出率分别为45.28%、90.57%、100%和100%,大多数雪里蕻OD405值随接种后天数的增加而呈上升趋势,说明TuMV可以在雪里蕻抗性品种内繁殖,抗性品种的抗性主要表现为耐病。

关键词：芜菁花叶病毒雪里蕻 tas-elisa HC-Pro基因 CP基因抗性

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利用elisa检测两种兰花病毒的研究

浙江农业学报 2009年第2期21卷 91-95页

作者：柳爱春刘超赵芸徐晓丹杭州市农业科学研究院浙江杭州310024

建立了三抗夹心酶联免疫吸附法(tas-elisa)检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-elisa)检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的方法。共检测了浙江省内139个兰科样品和8个百... 详细信息

建立了三抗夹心酶联免疫吸附法(tas-elisa)检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-elisa)检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的方法。共检测了浙江省内139个兰科样品和8个百合科样品,结果表明有31.7%的兰花检出CymMV,有28.8%的兰花检出ORSV。根据病毒外壳蛋白基因上下游保守序列设计了检测ORSV的引物,参照周国辉报道设计了检测CymMV的引物并对人工接种两种病毒的兰花进行了逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,结果表明,RT-PCR检测结果与elisa结果相一致,进一步证实本研究建立的tas-elisa,DAS-elisa方法稳定可靠,重复性好,可应用于兰花上CymMV和ORSV两种病毒的早期诊断和检测。

关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒 tas-elisa DAS-elisa 一步法RT-PCR

柑橘黄龙病菌和甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用

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柑橘黄龙病菌和甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用

作者：黄德青浙江大学

学位级别：硕士

植物细菌性病害是一类非常重要的植物病害,世界上已经报道的植物细菌性病害有500多种,我国记录的细菌病害有150种以上。植物细菌病害病原细菌可危害农作物、蔬菜、花卉、果树、林木和药用植物等。其中由柑橘黄龙病菌(Candidatus liberib... 详细信息

植物细菌性病害是一类非常重要的植物病害,世界上已经报道的植物细菌性病害有500多种,我国记录的细菌病害有150种以上。植物细菌病害病原细菌可危害农作物、蔬菜、花卉、果树、林木和药用植物等。其中由柑橘黄龙病菌(Candidatus liberibacter asiaticus)引起的柑橘黄龙病(Citrus huanglongbing,HLB)和达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)引起的甘薯茎腐病(Stem and root rot desease of sweet potato)在中国地区爆发,造成严重的经济损失。建立快速、灵敏的检测技术是这两种植物细菌病害诊断和防控的关键。血清学检测技术操作简单、特异性好、灵敏度高,适合大规模样品检测。因此,该技术在植物细菌病害的诊断和检测中广泛应用。但目前国内外还没有具有特异性和广谱性的柑橘黄龙病菌单抗,也没有检测甘薯茎腐病菌的血清学技术报道。为此,本论文分别制备了抗柑橘黄龙病菌和抗甘薯茎腐病菌的单克隆抗体,并以单克隆抗体为核心分别建立了快速、可靠地检测这两种病原菌的血清学技术,为这两种细菌病害的诊断与检测、预测预警和科学防控提供技术支持。(1)柑橘黄龙病菌单克隆抗体的制备及应用:以感染柑橘黄龙病菌的叶脉组织粗提液作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、细胞培养、抗体检测和细胞克隆获得了 6株能分泌抗柑橘黄龙病菌单抗的杂交瘤细胞株(6A7、9A1、11H9、10G1、13F11和18F12)。6株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接elisa效价在10-6至10-7之间,抗体类型均为IgG1,kappa轻链。Western blot试验结果显示,其中6A7、13F11和18F12单抗能与感染柑橘黄龙病的叶脉组织中大小约115kDa的蛋白发生特异性免疫反应,11H9单抗与感染柑橘黄龙病叶脉组织中大小约56kDa的蛋白发生特异性免疫反应。其他单抗的Western blot没有杂交信号,推测其针对空间构像型抗原决定簇。以制备的单抗为核心建立了检测柑橘黄龙病菌ACP-elisa和dot-elisa的血清学方法。建立的两种血清学方法检测感染柑橘黄龙病菌病叶呈特异性免疫反应,而与健康柑橘叶片呈阴性反应。广谱性试验结果显示,两种血清学方法均能与广西、江西、浙江以及重庆的柑橘黄龙病叶呈阳性反应。其中以6A7和10G1单抗为核心建立的ACP-elisa方法的灵敏度较高,检测感染黄龙病菌叶脉粗提液的灵敏度均达到1:10240倍稀释(w/v,g/mL),以9A1、18F12、11H9或13F11单抗为核心建立的ACP-elisa方法的灵敏度也可达到1:5120倍稀释;以6A7单抗为核心建立的dot-elisa方法的灵敏度最高,检测感染黄龙病菌叶脉粗提液的灵敏度高达1:10240倍稀释(w/v,g/mL),以18F12单抗为核心建立的dot-elisa方法的灵敏度为1:5120倍稀释,以10G1单抗为核心建立的dot-elisa方法的灵敏度为1:2560倍稀释,而以13F11、9A1或11H9单抗为核心建立的dot-elisa方法的灵敏度也可达到1:1280倍稀释。用建立的血清学方法检测广西、江西、浙江和重庆地区的125个柑橘样品,有83个样品感染了黄龙病菌,检测结果与PCR检测结果一致。PCR产物的核酸测序和序列比对证明血清学方法的准确性。(2)甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用:以甘薯茎腐病致病菌FY1710菌株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了 5株能够分泌抗甘薯茎腐病菌单抗的杂交瘤细胞株(25C4、16C10、9B1、6H4和9H10)。5株杂交瘤细胞株分泌的单抗的间接elisa效价在10-6到10-7之间,抗体类型均为IgG1,kappa轻链。以制备的单抗为核心分别建立了检测甘薯茎腐病菌的ACP-elisa,tas-elisa,dot-elisa和Tissue blot-elisa血清学检测方法。灵敏度分析结果表明,建立的ACP-elisa、tas-elisa、dot-elisa检测甘薯茎腐病菌的灵敏度分别高达1:107、1:108和1:108倍稀释(菌体湿重/体积,g/mL),且3种血清学检测方法与分析的非致病菌均呈阴性反应。建立的Tissue blot-elisa方法能够特异性地检测感病甘薯植物组织中的甘薯茎腐病菌,而与健康的甘薯植物组织不发生任何免疫反应。

关键词：柑橘黄龙病柑橘黄龙病菌甘薯茎腐病甘薯茎腐病菌单克隆抗体 ACP-elisa dot-elisa tas-elisa Tissue blot-elisa

蚕豆萎蔫病毒2VP37蛋白的细胞定位及核酸结合特性研究

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蚕豆萎蔫病毒2VP37蛋白的细胞定位及核酸结合特性研究

作者：黄晓（王品木）浙江大学

学位级别：硕士

蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)RNA2编码的前体蛋白能切割加工产生一种C—端重叠的功能未知的蛋白，分子量分别为53kD和37kD，因而将其命名为VP53／VP37。通过与同科的豇豆花叶病毒(CPMV)基因组编码区的比较发现，VP53／VP37与CPMV58-kD／48-kD... 详细信息

蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)RNA2编码的前体蛋白能切割加工产生一种C—端重叠的功能未知的蛋白，分子量分别为53kD和37kD，因而将其命名为VP53／VP37。通过与同科的豇豆花叶病毒(CPMV)基因组编码区的比较发现，VP53／VP37与CPMV58-kD／48-kD移动蛋白的编码位置相同并存在一定同源性，并且VP53／VP37内含有病毒移动蛋白特有的“30K超组”保守模体。为研究VP37在寄主细胞中的作用机制及其在细胞中的分布，通过胶体金间接标记6His-VP37兔抗血清，同时还标记了病毒的外壳蛋白单克隆抗体，对BBWV-2分离物B935感染的病叶超薄切片的电子显微镜观察发现：病毒粒子除了聚集在胞质中，还存在于寄主的叶绿体内;VP37蛋白能在细胞壁上形成管状结构，在胞质中亦有分布。通过叶绿体的Western-blot检测亦证明病毒粒子在叶绿体中的存在，而VP37蛋白在叶绿体中分布较少。病毒的移动蛋白具有结合核酸的能力，包括移动机制与管状结构和病毒粒子相关的移动蛋白。为了验证VP37是否具有核酸结合能力，我们利用6His-VP37蛋白进行了核酸结合实验，结果表明VP37是一种能非特异性结合单链核酸的蛋白;其在结合核酸时具有协同性;Na的变化对其核酸结合能力影响较小。实验结果进一步表明VP37是BBWV-2的可能的移动蛋白。将VP53／VP37基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因通过PCR融合，克隆至表达载体pRTL2。GFP融合体系的构建为研究VP53／VP37在细胞中的作用机制及其在植株胞间移动和系统运输中的作用打下了基础。利用已获得的针对蚕豆萎蔫病毒1(BBWV-1)和蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)的不同单克隆抗体细胞株对BBWV-1和BBWV-2进行了tas-elisa检测，建立了对BBWV-1和BBWV-2不同分离物的单抗检测体系，为BBWV-1和BBWV-2的鉴定检测提供了基础。

关键词：蚕豆萎蔫病毒移动蛋白胶体金细胞病理学核酸结合绿色荧光蛋白融合单克隆抗体 tas-elisa

苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测技术

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苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测...

作者：孙朱元吉浙江大学

学位级别：硕士

近年来,果树病毒病在全世界广泛发生流行,造成水果产业的产量和品质严重下降,甚至带来毁灭性的经济损失。其中,引起苹果茎痘病的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和引起苹果茎沟病的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving Virus... 详细信息

近年来,果树病毒病在全世界广泛发生流行,造成水果产业的产量和品质严重下降,甚至带来毁灭性的经济损失。其中,引起苹果茎痘病的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和引起苹果茎沟病的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving Virus,ASGV)是果树病毒病中两种非常重要的病毒。果树一旦感染病毒则终生带毒,且无药剂可防治,所以建立病毒的检测技术和监控体系是果树病毒病防控的关键。血清学方法具有操作简单、快速、灵敏、高通量等优点,是果树病毒检测和调查最实用的方法。鉴于目前我国还没有建立ASPV和ASGV这两种病毒的血清学检测技术的现状,本论文利用杂交瘤技术分别制备了 ASPV和ASGV的单克隆抗体,并以制备单抗为核心分别建立这两种病毒的特异、灵敏的血清学检测技术,从为这两种病毒的果园诊断和检测、流行病学研究和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。***的单抗制备及其血清学检测技术:将ASPV梨分离物的外壳蛋白基因(CP)用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌中进行表达,并用Ni2+-NTAagarose胶纯化,纯化蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合、筛选和克隆后获得4株分泌抗ASPV单抗的杂交瘤细胞株(2H2,14C3,20G6和20F9)4株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接elisa效价达10-6,抗体类型及亚型为IgG1、κ链。Western blot分析表明,4株单抗均能与ASPV重组外壳蛋白和感染ASPV的梨树病叶中的病毒衣壳蛋白发生特异性免疫反应,不与感染ASGV、ACLSV和感染ASPV苹果分离物的苹果病叶和健康果树叶片发生免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASPV的dot-elisa、tas-elisa和DAS-elisa方法,它们的检测感染ASPV梨病叶粗提液的灵敏度分别达到了 1:1,280、1:10,240和1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。应用建立的血清学方法对采自湖北武汉、北京和陕西西安和浙江杭州的168份疑似病毒病样品进行检测,结果发现用血清学方法检测到共有96份样品感染ASPV,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到94.8～96.9%,说明建立的血清学方法能有效、准确地检测梨树中的ASPV,且该病毒在我国果园发生普遍。ASPV单抗的制备及其血清学检测技术的建立对我国ASPV梨分离物的检测、诊断和防控具有重要意义。***的单抗制备及其血清学检测技术:利用大肠杆菌原核表达的ASGV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,制备了两株抗ASGV的特异性单抗(9B10和19B10)和1个ASGV CP蛋白的兔多抗。9B10和19B10单抗腹水的间接elisa效价均达到10-7。2株单抗的抗体类型及亚型均为IgG1、κ链。单抗的特异性分析发现,2株单抗均能与感染ASGV果树病叶和重组表达的ASGV CP蛋白发生特异性免疫反应,而不与感染ASPV和ACLSV的果树病叶组织、健康苹果、梨树和柑橘的叶片组织粗提液发生任何免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASGV的dot-elisa和tas-elisa两种血清学方法。其中dot-elisa方法检测感染ASGV苹果和梨病叶粗提液的灵敏度达到了 1:640倍稀释,检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:2,560倍稀释(w/v,g/ml),而tas-elisa方法检测感染ASGV苹果和梨病叶的灵敏度达到了 1:5,120倍稀释(w/v,g/ml),检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。对采自湖北、陕西、北京、浙江各地的187份疑似果树病叶样品进行血清学方法的检测,共检测到79份样品显示ASGV阳性,且dot-elisa和tas-elisa的检测结果和RT-PCR的结果符合率达到96.3%以上,说明建立的检测ASGV的血清学方法能有效、准确地检测果树中的ASGV。ASGV单抗的制备及其血清学技术的建立为我国ASGV的诊断和检测、流行病学研究和无毒种苗的生产提供技术支撑。

关键词：苹果茎痘病毒苹果茎沟病毒单克隆抗体 dot-elisa DAS-elisa tas-elisa