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基于tail-pcr分析外源基因在小鼠精原细胞中的整合位点

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肇庆学院学报 2022年第2期43卷 71-76页

作者：冯美莹曾梓凡邝乃诵温淑桦刘文华王瑛华肇庆学院生命科学学院广东肇庆526061

外源基因在哺乳动物细胞的整合位点会影响宿主细胞的生殖发育,在基因功能研究中常常会先确定其整合的染色体位置.为研究外源基因在小鼠精原细胞中的整合位点,以转入Cas9基因的小鼠精原细胞为研究材料,通过tail-pcr克隆Cas9整合到基因组... 详细信息

外源基因在哺乳动物细胞的整合位点会影响宿主细胞的生殖发育,在基因功能研究中常常会先确定其整合的染色体位置.为研究外源基因在小鼠精原细胞中的整合位点,以转入Cas9基因的小鼠精原细胞为研究材料,通过tail-pcr克隆Cas9整合到基因组的旁侧序列,结合T载体连接和碱基测序技术在有限的基因组中检测Cas9整合到小鼠基因组的具体位置.结果表明,转入外源基因的小鼠精原细胞折光性好,生长良好,pcr扩增发现Cas9基因成功转入到小鼠精原细胞的基因组上;结合上游特异性引物和简并引物可扩增出2条特异性条带,测序发现均为载体序列;结合下游特异性引物和简并引物可扩增出4条特异性条带,其中有2条扩增片段属于载体序列,2条扩增片段为小鼠基因组12号染色体中的序列.这表明外源基因整合到小鼠精原细胞12号染色体上.

关键词：整合位点 tail-pcr 小鼠 Cas9 外源基因

优化的反向pcr结合tail-pcr法克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列

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生物工程学报 2012年第1期28卷 104-115页

作者：张晓张锐孙国清史计孟志刚周焘侯思宇梁成真于源华郭三堆中国农业科学院生物技术研究所国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程北京100081 长春理工大学生命科学技术学院吉林长春130022

双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向pcr(Inverse pcr,ipcr)与tail-pcr相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的i... 详细信息

双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向pcr(Inverse pcr,ipcr)与tail-pcr相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的ipcr方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。根据ipcr结果,进一步用tail-pcr扩增更远侧翼的序列。利用这套方法,获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpA基因的所有EcoR I限制片段(2.2～5.1 kb)和HindⅢ限制片段(8.5～11.7 kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。研究结果说明,优化的ipcr与tail-pcr相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。

关键词：反向pcr tail-pcr 细胞质雄性不育棉花 atpA 双拷贝基因侧翼序列

tail-pcr技术分离柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列

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华北农学报 2009年第1期24卷 108-111页

作者：冷春玲辽东学院农学院生物系辽宁丹东118003

以柞蚕基因组DNA为材料,采用热不对称交错pcr(tail-pcr)技术分离出1 998 bp的DNA序列。将该序列与Genebank上的柞蚕丝素基因DNA序列(AF083334)进行比较分析结果表明,新钓取的DNA片断中1 758 bp的DNA序列为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知... 详细信息

以柞蚕基因组DNA为材料,采用热不对称交错pcr(tail-pcr)技术分离出1 998 bp的DNA序列。将该序列与Genebank上的柞蚕丝素基因DNA序列(AF083334)进行比较分析结果表明,新钓取的DNA片断中1 758 bp的DNA序列为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列。tail-pcr技术为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列的钓取提供了一种简便、高效的方法。

关键词： tail-pcr 丝素基因简并引物侧翼序列

Efficient Amplification and Sequence Analysis of aroA Gene Sequence of Flavobacterium johnsoniae through tail-pcr

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Agricultural Science & Technology 2010年第7期11卷 179-182页

作者：刘礼辉李宁求石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所广东广州510380

[Objective] The aim was to study the sequence of aroA gene （synthetic gene in metabolic pathway of aromatic amino acids） of a pathogenic bacterium （Flavobacterium johnsoniae） causing gill-rote disease.[Method] Genomic DNA of strain M165 of *** was used as a template,three specific nested primers of 5＇end and 3＇end and arbitrary primer were used to amplify the aroA gene of strain M165 through Thermal asymmetric interlaced pcr （tail-pcr）.And the obtained sequence was analyzed.[Result] The electrophoresis determination result showed that the size of amplified product was consist with the expected product; sequencing analysis suggested that the full-length of aroA gene was 1 230 bp,enconding 410 amino *** amino acid sequence of aroA protein showed the highest level of similarity to amino acids sequence of aroA protein of ***.[Conclusion] tail-pcr provided a simple and efficient new method for the cloning of the gene *** of full-length of aroA gene provided a foundation for further investigation on the effects of nutrition correlation factors such as aroA on the virulence of and virulence of ***.

关键词： tail-pcr Gill-rote disease Flavobacterium johnsoniae aroA gene

一种DNA侧翼序列分离技术——tail-pcr

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南京林业大学学报（自然科学版） 2003年第4期27卷 87-90页

作者：罗丽娟施季森南京林业大学

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错pcr(简称tail pcr)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的pcr循环,... 详细信息

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错pcr(简称tail pcr)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的pcr循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。tail pcr技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔者综述了tail pcr反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。

关键词： DNA侧翼序列分离技术 tail-pcr 分子生物学基因克隆分子杂交探针制备

利用tail-pcr和RT-pcr技术克隆云芝植酸酶基因

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应用与环境生物学报 2006年第5期12卷 618-622页

作者：杨帆林俊芳苗灵凤郭丽琼中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验室右江民族医学院广西百色533000

从采绒革盖菌(Coriolus versicolor,常被称为杂色云芝)中筛选到产植酸酶基因.根据植酸酶基因的保守序列设计引物P1、P2,从云芝中分离克隆植酸酶基因的片段.再在分离到的已知序列的5′端和3′端设计嵌套的特异引物SP1、SP2、SP3和SP1′、... 详细信息

从采绒革盖菌(Coriolus versicolor,常被称为杂色云芝)中筛选到产植酸酶基因.根据植酸酶基因的保守序列设计引物P1、P2,从云芝中分离克隆植酸酶基因的片段.再在分离到的已知序列的5′端和3′端设计嵌套的特异引物SP1、SP2、SP3和SP1′、SP2′、SP3′,利用tail-pcr技术进行分离已知序列的侧翼序列.结合Blastn、ORF和Primer5.0软件,在侧翼序列上设计特异引物P3、P4,最终从云芝中分离克隆到全长的植酸酶基因B4.再在B4序列的基础上设计引物phyP rt1、phyP rt2,利用这两个引物通过RT-pcr技术从云芝中克隆到全长的植酸酶基因B5.通过分析,分离克隆到的植酸酶基因可能是新的基因.

关键词：云芝植酸酶 tail-pcr RT-pcr

应用tail-pcr扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

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应用与环境生物学报 2009年第6期15卷 871-874页

作者：侯雷平王小菁李洪清李梅兰华南师范大学生命科学院广东省植物发育生物工程重点实验室广州510631 山西农业大学园艺学院太谷030801

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用tail-pcr成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,... 详细信息

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用tail-pcr成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

关键词：蓝猪耳 tail-pcr T-DNA 整合位点侧翼序列

不同tail-pcr通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

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核农学报 2013年第7期27卷 922-928页

作者：陈笑芸汪小福刘仁虎张小明周育缪青梅徐俊锋浙江省农业科学院浙江杭州310021

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对tail-pcr的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了tail-pcr分析,结果表明,5个简并引物在tail-pcr中的扩... 详细信息

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对tail-pcr的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了tail-pcr分析,结果表明,5个简并引物在tail-pcr中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的tail-pcr扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2tail-pcr成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高tail-pcr中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

关键词： tail-pcr 简并引物转基因大豆转基因水稻转基因油菜侧翼序列

改进tail-pcr方法克隆产甲烷古菌的mcr基因簇

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应用与环境生物学报 2013年第2期19卷 356-359页

作者：朴玉华徐彦胜胡国全农业部沼气科学研究所农业部农村可再生能源开发利用重点实验室成都610041

甲基辅酶M还原酶(MCR)在产甲烷古菌中普遍存在并具有重要意义,其基因成簇存在,约5.8 kb,其中α亚基核酸序列相对保守,是较易获得的保守序列.为了快速和简便地获得mcr基因簇,本研究根据甲基辅酶M还原酶β亚基(MCRB)的蛋白基序和密码子表... 详细信息

甲基辅酶M还原酶(MCR)在产甲烷古菌中普遍存在并具有重要意义,其基因成簇存在,约5.8 kb,其中α亚基核酸序列相对保守,是较易获得的保守序列.为了快速和简便地获得mcr基因簇,本研究根据甲基辅酶M还原酶β亚基(MCRB)的蛋白基序和密码子表设计了4条AD引物,经过改良的tail-pcr发现其中3条AD引物都获得了大于3 kb并且正确的片段.本研究所获得的基因可为甲基辅酶M还原酶的深入研究奠定基础,相较于传统的tail-pcr方法,本研究对其的改进拓宽了其在获得大片段基因簇及侧翼序列方面的适用性,并可为其他类似基因簇的获得提供参考.

关键词： tail-pcr AD引物设计甲基辅酶M还原酶产甲烷古菌 mcr基因簇