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具有除草剂抗性的ta克隆植物表达载体的构建

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基因组学与应用生物学 2015年第11期34卷 2436-2440页

作者：李梦婷谭文雍孙铭阳李永光李文滨大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室东北农业大学哈尔滨150030

ta克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆且操作简单,因此被广泛应用。p CXSN是以ta克隆为连接方式的植物表达载体,T-DNA区筛选标记为潮霉素抗性基因。本实验利用抗除草剂基因bar、gdh A替换载体上的潮霉素基因,构建了两种可以直接连接... 详细信息

ta克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆且操作简单,因此被广泛应用。p CXSN是以ta克隆为连接方式的植物表达载体,T-DNA区筛选标记为潮霉素抗性基因。本实验利用抗除草剂基因bar、gdh A替换载体上的潮霉素基因,构建了两种可以直接连接PCR产物的ta克隆植物表达载体,获得的含有除草剂抗性基因的p CXSN表达载体适合用于基因的正义和反义表达,不需要添加酶切位点,可以直接连接PCR产物,节省载体构建的步骤和时间。

关键词：植物表达载体 ta克隆除草剂

应用BSP联合ta克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

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南京医科大学学报（自然科学版） 2012年第1期32卷 72-76页

作者：彭泉张立洁蔡辉华高文涛赵成功钱祝银苗毅南京医科大学第一附属医院普外科江苏南京210029 解放军第105医院普外科安徽合肥230032 解放军第105医院肿瘤科安徽合肥230032

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联... 详细信息

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合ta克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。

关键词：胰腺癌甲基化 Ras相关区域家族1A 重亚硫酸盐测序PCR ta克隆

甲基化芯片+ta克隆测序研究胰腺癌细胞株中异常甲基化miRNA

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甲基化芯片+TA克隆测序研究胰腺癌细胞株中异常甲基化miRNA

作者：彭泉南京医科大学

学位级别：硕士

目的研究pre-miRNA在胰腺癌细胞株PANC-1与正常胰腺组织中启动子区的甲基化程度差异,找到与胰腺癌相关、存在异常甲基化的miRNA。方法采用“MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation) +甲基化芯片”方法分别对在胰腺癌细胞株PANC-1和... 详细信息

目的研究pre-miRNA在胰腺癌细胞株PANC-1与正常胰腺组织中启动子区的甲基化程度差异,找到与胰腺癌相关、存在异常甲基化的miRNA。方法采用“MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation) +甲基化芯片”方法分别对在胰腺癌细胞株PANC-1和正常胰腺组织进行芯片分析,从中筛选出在PANC-1与正常胰腺组织中存在启动子区甲基化峰值的miRNA。从PANC-1和正常胰腺组织中提取基因组DNA,进行重亚硫酸盐处理,以处理后的DNA为模板进行BSP,2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物,将纯化后产物进行ta克隆,挑选阳性单克隆菌落进行菌液PCR,挑选阳性菌液送测序,对芯片结果进行验证。提取胰腺癌细胞株BXPC-3、CFPAC-1、PANC-1、SW1990的基因组DNA,进行BSP反应(bisulfite genomic sequencing PCR,重亚硫酸盐测序PCR),对PCR产物进行COBRA酶切(combined bisulfite restriction analysis,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法),检测miRNA在多种胰腺癌细胞株中的甲基化状态。结果测序结果显示:miRNA-615、miRNA-663、miRNA-663b在PANC-1中的甲基化率明显高于正常组织(60.6%:7.6%,88.8%:22.2%,94.4%:13.0%),miRNA-675在PANC-1和正常胰腺组织中的甲基化率无明显差异(76.0%:100%);COBRA示:miRNA-663在四种胰腺癌细胞株中均有不同程度的甲基化,而miRNA-615在CFPAC-1中,miRNA-663b在SW1990中,miRNA-675在BXPAC无明显甲基化。结论“MeDIP +甲基化芯片+ta克隆测序”可以作为准确筛查异常甲基化的miRNA的有效方法。在四种胰腺癌细胞株中miRNA-615、miRNA-663、miRNA-663b、miRNA-675均存在不同程度的甲基化。

关键词：胰腺癌 DNA甲基化 miRNA ta克隆 COBRA

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ta克隆的快速鉴定

卫生研究 2004年第6期33卷 704-704页

作者：张佳炜陈功星郑树浙江大学医学院浙医二院肿瘤研究所杭州310009

ta克隆技术原理是taq酶参与的PCR反应中,产物双链核酸中的3′端各多连接一个脱氧腺嘌呤核苷酸(A),与商业开发的5′端各多一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)的质粒载体,在DNA连接酶作用下,按碱基配对形成环状的完整质粒,转化细菌,质粒扩增形成克... 详细信息

ta克隆技术原理是taq酶参与的PCR反应中,产物双链核酸中的3′端各多连接一个脱氧腺嘌呤核苷酸(A),与商业开发的5′端各多一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)的质粒载体,在DNA连接酶作用下,按碱基配对形成环状的完整质粒,转化细菌,质粒扩增形成克隆.由于存在载体自连的现象,ta克隆的鉴定十分必要,本文利用快速质粒提取和载体中现有的成对限制性内切酶位点,使ta克隆技术更方便实用.

关键词： ta克隆快速鉴定脱氧胸腺嘧啶核苷酸质粒载体

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ta克隆的应用研究

山东医科大学学报 2001年第3期39卷 201-202页

作者：栾怡于修平宋长芹卞继峰赵蔚明周亚滨贾继辉山东大学医学院

目的 :探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术。方法 :为制备T载体 ,用SmaI消化质粒 pUC18成纯末端 ,纯化后与taqDNA聚合酶及dTTP ,75℃反应 2h ,构建成加上T尾的线性 pUC18载体。将由质粒 pBR32 2 HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基... 详细信息

目的 :探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术。方法 :为制备T载体 ,用SmaI消化质粒 pUC18成纯末端 ,纯化后与taqDNA聚合酶及dTTP ,75℃反应 2h ,构建成加上T尾的线性 pUC18载体。将由质粒 pBR32 2 HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基因扩增产物 ,根据ta克隆策略克隆至pUC18 T载体中 ,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子 ,并对ta克隆连接条件做了探讨。结果 :获得重组质粒 pUC18 E6。结论 :ta克隆采用低温延时连接 ,阳性克隆率高 ,是高效。

关键词： ta克隆聚合酶链反应乳头状瘤病毒基因 E6

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中成药中全蝎掺伪DNA分子鉴定

药物分析杂志 2024年第7期44卷 1267-1275页

作者：段宝丽尤春雪蒋超道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室中国中医科学院中药资源中心北京100700 天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392

目的:建立有效检出中成药中细尖狼蝎成分的方法,检测获得中成药中全蝎掺伪情况。方法:收集《中华人民共和国药典》收载的30种含全蝎成分的中成药,提取DNA,比对线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列差异,分别设计全蝎源性和细尖狼... 详细信息

目的:建立有效检出中成药中细尖狼蝎成分的方法,检测获得中成药中全蝎掺伪情况。方法:收集《中华人民共和国药典》收载的30种含全蝎成分的中成药,提取DNA,比对线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列差异,分别设计全蝎源性和细尖狼蝎源性特异性鉴别引物并对退火温度、循环次数、taq酶以及DNA浓度进行优化,最终确定细尖狼蝎最适PCR鉴别条件包括退火温度52℃,循环数为36,taq酶为2×PCR Mix,DNA模板为1μL,通过建立的中成药中细尖狼蝎成分检出方法对市售30种中成药中全蝎投料情况进行鉴定。结果:经凝胶电泳检测,30个全蝎成分中成药均检出正品东亚钳蝎特有DNA条带,18种中成药(60%)在100~250 bp可见单一细尖狼蝎特异性DNA条带,空白对照无条带。对检出细尖狼蝎特异性条带的PCR产物进行ta克隆后测序,序列均与细尖狼蝎参考序列具有很高的相似性(92%~98%),系统发育结果表明获得的序列均与细尖狼蝎为同一支系而与东亚钳蝎不同,因此在120 bp左右出现单一条带可鉴定为细尖狼蝎。结论:中成药中全蝎投料存在以细尖狼蝎掺伪全蝎投料的现象,需要加强监管。本研究建立的方法可以快速准确检出中成药中细尖狼蝎成分,有利于完善全蝎中成药的质量控制方法,为其临床应用提供保障。

关键词：中成药全蝎东亚钳蝎细尖狼蝎聚合酶链式反应分子鉴定 ta克隆系统发育树

ta载体pEASY-T1 Simple在基因克隆中的新应用

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天津农学院学报 2011年第2期18卷 13-15,19页

作者：杨文丽丁博王俊斌李明吕芳芳谢晓东天津农学院农学系天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心天津300384

在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 S imp le载体无酶切位点的特点,通过ta克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进... 详细信息

在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 S imp le载体无酶切位点的特点,通过ta克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进行了验证。最后证明,这种方法可高效构建含有不同多克隆位点的载体,克服了对常用克隆载体的依赖,大大提高了基因操作的灵活性和有效性。

关键词： ta克隆 pEASY-T1 Simple 多克隆位点

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甩掉光盘做Vista克隆

网友世界 2007年第19期 62-63页

作者：飘飘

在Windows XP系统里，我们可以使用Ghost光盘或是一键还原等多种方式对系统进行备份和还原，非常方便。但是在Windows Vista系统下，像一键还原这类硬盘式备份工具均已失效，只能使用Vista安装光盘或光盘版Ghost具进行系统备份和还原，... 详细信息

在Windows XP系统里，我们可以使用Ghost光盘或是一键还原等多种方式对系统进行备份和还原，非常方便。但是在Windows Vista系统下，像一键还原这类硬盘式备份工具均已失效，只能使用Vista安装光盘或光盘版Ghost具进行系统备份和还原，非常麻烦。其实不然，下面三个方法就可以让你不用光盘，照样给Vista系统做好备份和还原。

关键词： Vista 光盘版 ta克隆 Windows 备份工具 P系统安装光盘还原

利用非培养技术研究古井贡酒大曲中的细菌群落结构

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现代食品科技 2014年第4期30卷 44-49页

作者：张会敏束莹周庆伍李安军何宏魁张治洲哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院山东威海264209 古井贡酒集团股份有限责任公司安徽亳州236826

淡雅型白酒古井贡酒大曲中的微生物群落结构一直未在分子水平上得到解析。本文采用构建16s rDNA克隆文库的非培养方法对古井贡酒中温大曲和高温大曲进行细菌群落结构及其多样性研究。所有克隆菌株归为36个OUT,分别属于厚壁菌门(Firmicut... 详细信息

淡雅型白酒古井贡酒大曲中的微生物群落结构一直未在分子水平上得到解析。本文采用构建16s rDNA克隆文库的非培养方法对古井贡酒中温大曲和高温大曲进行细菌群落结构及其多样性研究。所有克隆菌株归为36个OUT,分别属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和一些未培养菌类,其中厚壁菌门占多数。总体来说,中温大曲明显要比高温大曲细菌多样性更丰富一些。高温大曲的菌种相对比较单一,绝大多数为高温放线菌Thermoactinomyces sanguinis,而且仅存在于高温大曲中,占到高温大曲表面菌群的79.5%,高温大曲曲心菌群的98.5%。中温大曲的两个样本差距比较大。样本S1的优势菌为枝芽孢菌属(Virgibacillus sp.),占85.3%,另外还有少量的未培养菌类(12.9%)。中温大曲S2的细菌多样性比较丰富,优势菌属为乳杆菌属Lactobacillus(25.2%)、葡萄球菌属Staphylococcus(14.3%)、芽孢杆菌属Bacillus(13.4%)和各种未培养菌类(16.8%)。古井大曲中存在大量潜在新种,需要进一步鉴定。

关键词：古井贡酒中温大曲高温大曲细菌群落 ta克隆