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广西医科大学学报 2015年第6期32卷 887-890页

作者：兰博谢秋巧明建军黄仁彬张士军广西医科大学药学院药理学教研室南宁530021

目的:比较t7e1和Surveyor核酸内切酶对于CRISPR-Cas9引起的点突变的错配剪切活性。方法:利用野生型和点突变的基因组DNA为模板,PCR扩增出突变位置的基因片段,用不同比例的野生型和点突变的PCR产物进行DNA杂交,分别用t7e1和Surveyor核酸... 详细信息

目的:比较t7e1和Surveyor核酸内切酶对于CRISPR-Cas9引起的点突变的错配剪切活性。方法:利用野生型和点突变的基因组DNA为模板,PCR扩增出突变位置的基因片段,用不同比例的野生型和点突变的PCR产物进行DNA杂交,分别用t7e1和Surveyor核酸内切酶对杂交后的产物进行切割,琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果:当5%点突变DNA与95%野生型DNA杂交时,t7e1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为9.5%,Surveyor核酸内切酶为3.2%;当点突变DNA与野生型DNA等比例杂交时,t7e1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为45.6%,Surveyor核酸内切酶为26.4%;且t7e1和Surveyor核酸内切酶均能检测5%的突变DNA。结论:t7e1核酸内切酶检测点突变的效率高于Surveyor。

关键词： t7e1 Surveyor 点突变杂交错配剪切活性

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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

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作者：邹定峰北京协和医学院

学位级别：硕士

精子发生是指通过一系列有丝分裂和减数分裂从精原干细胞至产生单倍体圆形精子细胞,这些细胞又经历复杂的形态重塑,最终分化成成熟的精子的过程。在这个复杂的过程中,细胞受许许多多基因的精密调控,研究并解析这一精密的调控网络成为解... 详细信息

精子发生是指通过一系列有丝分裂和减数分裂从精原干细胞至产生单倍体圆形精子细胞,这些细胞又经历复杂的形态重塑,最终分化成成熟的精子的过程。在这个复杂的过程中,细胞受许许多多基因的精密调控,研究并解析这一精密的调控网络成为解开精子发生谜团的重要一步。然而,由于精子发生过程的高度复杂性以及对体内微环境的高度依赖性,使得到目前为止没有较好的培养系统能够在体外实现完整的精子发生过程。因此,探索新的精子发生研究方法是-个亟待解决的问题。本研究利用同源重组技术将CRISPR Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体中,获得经改造的AAV-sgRNA载体;随后,将验证过的人源Weel2#sgRNA构建入该载体中并行病毒包装;继之感染稳定表达spCas9的Hela-spCas9细胞,检测证明该载体能稳定表达并能够进行基因敲除。进一步我们以在睾丸组织特异表达、精子发生过程中减数分裂期的功能基因Sycp3作为目的基因,验证上述系统的可行性。首先,筛选Sycp3的sgRNA靶点,构建入改造的AAV-sgRNA载体,行病毒包装;随后利用显微注射技术将病毒注射入睾丸组织特异表达spCas9蛋白质的小鼠睾丸曲细精管内,通过t7e1分析体内细胞的基因敲除效果，同时利用H&e染色、免疫荧光以及精子计数等表型检测方法观察敲除后精子发生表型的改变。结果发现，敲除sycp3后的睾丸组织相对于刚性对照的睾丸组织出现体积及休重变小、生殖细胞脱落以及成熟精子产生减少等明显的表型,其睾丸中大部分精子发生停滞。本研究成功建立了一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的快捷而有效的手段。

关键词：精子发生 CRISPR Cas9 AAV 病毒包装 t7e1 显微注射

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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

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基础医学与临床 2019年第4期39卷 501-508页

作者：邹定峰罗艳云李凯卢艳李永玲缪时英王琳芳宋伟中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005 无极县医院河北石家庄052460

目的建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统。方法利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee1 2#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas... 详细信息

目的建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统。方法利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee1 2#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率。筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过t7e1分析体内细胞的基因敲除效果。结果构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异。同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑。结论成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法。

关键词： CRISPR Cas9 AAV 病毒包装 t7e1 显微注射

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利用CRISPR系统介导人类mir-505基因位点的编辑

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现代生物医学进展 2016年第2期16卷 257-260,224页

作者：邓倩云常雪莹王斯佳肖君华李凯周宇荀东华大学生物科学与技术研究所上海201620

目的:通过针对人源mir-505基因,设计不同sgRNA,从而利用CRIPSR系统对mir-505基因位点进行编辑,并探讨CRISPR系统对靶点的剪切效率的影响因素。方法:针对人源mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将其构建入41824-sgRNA表达... 详细信息

目的:通过针对人源mir-505基因,设计不同sgRNA,从而利用CRIPSR系统对mir-505基因位点进行编辑,并探讨CRISPR系统对靶点的剪切效率的影响因素。方法:针对人源mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将其构建入41824-sgRNA表达载体和42230-Cas9蛋白/sgRNA共表达载体,并将表达载体利用脂质体转染法转染入人类细胞,通过t7e1assay检测不同CRISPR系统对靶点剪切效率的影响。结果:对靶点的剪切与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时,也能够明显提高靶点的剪切效率;而较低的sgRNA的GC%会降低其对靶点的剪切效率。结论:本研究利用CRISPR系统靶向人源细胞的mir-505基因,使得mir-505基因发生突变。CRISPR系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。

关键词： CRISPR系统 Mir-505 SgRNA t7e1 assay 剪切效率

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