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植物病理学报 2016年第1期46卷 27-36页

作者：刘国芳苏辉昭刘伟牛祥娜玉延华姜伟何勇强广西大学农学院南宁530004 广西大学生命科学与技术学院南宁530004 通化师范学院生命科学学院.通化134002

通过反向遗传学方法和半定量Rt-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spot_(Xcc)与Ⅲ型分泌系统(t3ss)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spot_(Xcc)基因(XC_0956)的非极性... 详细信息

通过反向遗传学方法和半定量Rt-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spot_(Xcc)与Ⅲ型分泌系统(t3ss)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spot_(Xcc)基因(XC_0956)的非极性整合突变体,检测了突变体的多种表型,发现spot_(Xcc)突变体延迟了在非寄主植物辣椒ECW-10R上引发的过敏反应(HR)。利用GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量Rt-PCR的方法,发现t3ss相关基因在spot_(Xcc)基因的非极性整合突变体中表达量降低,表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spot_(Xcc)显著正调控t3ss相关基因的表达。

关键词：十字花科黑腐病菌 spotXcc基因过敏反应(HR) t3ss 调控

温度对副溶血弧菌t3ss中相关基因表达的影响

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海洋科学进展 2016年第2期34卷 250-259页

作者：丁晓燕曲凌云王琛田欣欣孙承君王敏强烟台大学生命科学学院山东烟台264005 国家海洋局第一海洋研究所山东青岛266061 海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266237

III型分泌系统(type III secretion system,t3ss)是副溶血弧菌主要的毒力因子之一,能传递与致病有关的毒性因子来发挥病原菌的毒性,而温度是影响细菌基因表达等生命活动的关键生态因子。本文以AtCC17802和JA21作为实验菌株,分别提取其R... 详细信息

III型分泌系统(type III secretion system,t3ss)是副溶血弧菌主要的毒力因子之一,能传递与致病有关的毒性因子来发挥病原菌的毒性,而温度是影响细菌基因表达等生命活动的关键生态因子。本文以AtCC17802和JA21作为实验菌株,分别提取其RNA,在不同温度和温度应激条件下,以pvuA为内参基因,以副溶血弧菌t3ss1的vcrD1、vopS、vopD1和t3ss2的vscC2β、vcrD2β、vopP2β作为目的基因,运用荧光定量PCR(Rt-PCR)技术检测t3ss相关基因的表达下,用ΔΔCt法计算基因表达差异。结果表明:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)AtCC17802菌株的t3ss1基因在16℃表达量最高,t3ss2基因在25℃表达量最高。副溶血弧菌JA21菌株的t3ss1基因和t3ss2基因均在25℃表达量最高。2株副溶血弧菌从不同的培养温度转入到应激温度37℃后,t3ss1和t3ss2基因的表达量均被显著诱导,并表现出时间依赖性,呈现先升高后降低的趋势。这为进一步探究环境因素与副溶血弧菌致病力的关系提供了科学依据。

关键词：副溶血弧菌 t3ss Rt-PCR 基因表达

鼠伤寒沙门菌t3ss相关基因缺失株的生物学特性分析

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中国兽医学报 2023年第12期43卷 2463-2471页

作者：陈世雄段世宇张家莉杨婉杨琦贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州大学动物疫病研究所贵州贵阳550025 贵州省动物疫病研究室贵州贵阳550025

为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(StM t3ss)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力,本试验利用λ-Red同源重组技术构建t3ss相关基因缺失株Lt2ΔprgI::scar、Lt2ΔprgJ::scar、Lt2ΔprgH::scar、Lt2ΔprgK::scar、Lt2ΔinvG::scar、Lt2ΔinvC::scar和Lt2ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(StM Lt2)作为对照,通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别,结果显示:t3ss相关基因缺失株生长性变化不大,能够稳定遗传,但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱;对于缺失株Lt2ΔinvC::scar、Lt2ΔprgH::scar、Lt2ΔprgJ::scar和Lt2ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低,但仍有较强的成膜能力,其余菌株在缺失后,成膜能力显著降低;LD50测定结果显示,相对于StM Lt2,缺失株半数致死量LD_(50)数值均出现上升趋势,分别上升了2.57、4.07、406.76、161.89、89.75、89.75和64.45倍,证明缺失株毒力发生明显下降。以上结果为研究t3ss相关基因的生物学功能及沙门菌的致病性提供了理论基础,为鼠伤寒减毒疫苗研制与新型抗菌药物研发提供了新的思路。

关键词：鼠伤寒沙门菌 λ-Red同源重组 t3ss 生物学特性

某院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌t3ss毒力因子携带、表达和毒力与耐药的相关性及分子流行病学研究

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中国医院药学杂志 2024年

作者：韩美娟汤建华蒲洁琨赵林博庞茜茜刘云宁张鹤鸣河北北方学院药学院河北省神经药理学重点实验室河北北方学院附属第一医院药学部

目的：探究临床分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（carbapenem-resistent Pseudomonas aeruginosa，CRPA）Ⅲ型分泌系统（type III secretion system，t3ss）毒力因子携带、表达情况和毒力与耐药的相关性及分子流行病学规律。方法：微量... 详细信息

目的：探究临床分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（carbapenem-resistent Pseudomonas aeruginosa，CRPA）Ⅲ型分泌系统（type III secretion system，t3ss）毒力因子携带、表达情况和毒力与耐药的相关性及分子流行病学规律。方法：微量肉汤稀释法进行药敏试验；第二代高通量基因测序技术检测CRPA菌株t3ss中4种毒力因子（exoU、exoY、exoS、exot）和β-内酰胺酶基因的携带情况以及菌株的St分型；大蜡螟毒力试验评估菌株毒力水平；qRt-PCR实验检测毒力因子的相对表达水平。结果：收集2022年4月至2023年2月期间自河北北方学院附属第一医院分离的45株CRPA，结果显示t3ss中毒力因子检出率最高的是exot 100%，其次是exoS和exoY，均为88.9%，最低为exoU 11.1%。检测出18种β-内酰胺酶基因，以blaPDC-374、blaOXA-101、blaOXA-847、blaPER-1和blaOXA-50为主。检测出22种St分型，总体以St244 31.1%为主。45株CRPA在大蜡螟毒力试验中，5株表现为高毒力、25株表现为中毒力，15株表现为低毒力。不同毒力水平的CRPA菌株对哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星和阿米卡星的耐药率差异有统计学意义（P＜0.05）。qRt-PCR实验结果表明菌株毒力水平与毒力因子表达水平存在一定关系。结论：该院临床分离的CRPA毒力基因型以exoY+/exoS+/exot+/exoU-为主，显示出对氨曲南、美罗培南和左氧氟沙星具有更高的耐药性。多黏菌素B是对大多数分离株有效的药物。产blaOXA-101和blaPER-1酶的St244型菌株，已在该区域传播，应给予关注。t3ss中4种毒力因子携带、表达与菌株毒力水平和抗生素耐药性均存在关联。

关键词：耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌 t3ss 毒力因子耐药性分子流行病学

溶藻弧菌PhoP的赖氨酸乙酰化修饰对t3ss致病性的影响机制

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溶藻弧菌PhoP的赖氨酸乙酰化修饰对T3SS致病性的影响机制

作者：王俊霖广东海洋大学

学位级别：硕士

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引发海水经济动物弧菌病的主要病原之一,Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,t3ss）与溶藻弧菌的毒力密切相关。ExsA是t3ss的核心调控蛋白,可直接诱导效应蛋白的分泌,进而致宿主细胞死亡。另外... 详细信息

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引发海水经济动物弧菌病的主要病原之一,Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,t3ss）与溶藻弧菌的毒力密切相关。ExsA是t3ss的核心调控蛋白,可直接诱导效应蛋白的分泌,进而致宿主细胞死亡。另外还存在全局调节因子,可调控ExsA进而间接调控t3ss的分泌。蛋白翻译后修饰（Post-translational modifications,PtMs）是病原菌致病性的调控热点,研究已发现溶藻弧菌的一些全局调控因子具有乙酰化修饰（Kac）。据此,本论文结合蛋白质乙酰化修饰组学和分子生物学技术,研究全局调控因子的乙酰化修饰对溶藻弧菌毒力的影响,旨在揭示乙酰化修饰对细菌t3ss致病性的影响机制,为更好地预防和控制弧菌病提供靶点。主要结果如下:（1）为筛选溶藻弧菌HY9901 t3ss的调控因子,构建了t3ss诱导（HY9901:pexsA）和非诱导（HY9901:pexsD）菌株。利用4D非标定量蛋白质组学技术鉴定HY9901:pexsA和HY9901:pexsD的全菌蛋白赖氨酸乙酰化修饰水平,对差异修饰蛋白进行了生物信息学分析。结果发现:与t3ss非诱导株相比,t3ss诱导株共有461个蛋白的表达发生了变化,其中229个蛋白的表达显著上调,232个蛋白的表达显著下调;共有564个蛋白的Kac位点发生变化,其中271个修饰位点上调,293个修饰位点下调。这些差异修饰蛋白主要涉及细胞、代谢过程、核糖体和转录相关。基序分析发现有23个赖氨酸乙酰化修饰保守基序,其中出现频率最高的是RKac S（571次）,出现频率最低的是EKac（43次）。从上述乙酰化修饰差异显著的蛋白中,选取全局调节因子PhoP为研究对象,分析发现其在K189处具有Kac修饰位点。（2）对PhoP进行基因克隆、生物信息学分析、原核表达以及乙酰化修饰验证。结果表明:phoP基因全长为732 bp,功能结构域预测表明其具有REC和trans reg＿C结构域,三维结构分析发现其与结核分歧杆菌PhoP单亚基Reg X3结构相似。成功构建原核表达载体pGEX-4t-phoP并纯化,免疫小鼠得到鼠抗PhoP抗体,利用IP和Western blot技术,证明溶藻弧菌HY9901的PhoP天然蛋白和重组蛋白均具有Kac修饰,通过结合胶内酶解和高分辨生物质谱技术鉴定pGEX-4t-phoP重组蛋白在K46处具有Kac修饰位点。（3）采用Overlap PCR和同源重组技术成功构建了溶藻弧菌HY9901ΔphoP缺失株,并对其进行生物学表型和转录组测序分析。结果表明,phoP基因的缺失,对菌株的生长、胞外蛋白酶活性的表达无显著影响,但是显著下调了生物膜形成能力（0-6 h）、泳动能力和毒力。药敏试验结果表明相较于野生株,缺失株ΔphoP对头孢他啶、头孢咪唑的敏感性增强,但对头孢拉定、氨基糖苷类的抗生素敏感性减弱。比较转录组学结果表明:与HY9901相比,?phoP共有533个基因的表达发生显著变化,其中291个基因上调,242个基因下调。GO功能富集表明差异表达基因主要与合成相关,其次是核糖体。KEGG通路分析表明主要差异表达基因集中在双组份系统、核糖体、氨基酸生物合成。通过q PCR验证差异基因和t3ss的关系,发现ΔphoP中t3ss调控蛋白exsA和效应蛋白hop Pma J、vop N、vcr V、vop S基因的m RNA表达显著下调,证实转录组数据准确可靠。（4）在获得了回补株C-phoP的基础上,利用快速定点突变技术,将PhoP乙酰化修饰位点K189和K46的赖氨酸（K）分别突变成精氨酸（R,模拟去乙酰化修饰）、谷氨酰胺（Q,模拟乙酰化修饰）、丙氨酸（A,模拟该位点既不能乙酰化和也不能去乙酰化）。采用SWIss-MODEL预测位点突变对PhoP蛋白结构的影响,探究各乙酰化修饰位点的突变对胞外蛋白酶活性、斑马鱼存活能力和细胞毒性的影响。结果表明:SWIss-MODEL预测显示不同修饰位点的突变可引起PhoP蛋白空间结构产生不同程度的变化;与HY9901相比,K189、K46位点的突变对胞外蛋白酶活性影响不显著;K189R株对斑马鱼的毒力显著上升,而K189Q、K46R、K46A株的毒力显著下降,K46Q株的毒力与HY9901持平;FHM细胞感染试验发现,与HY9901相比,K189R株感染细胞后,Caspase-3和LDH的活性显著上升,而K189Q株的Caspase-3活性显著减弱;K189Q、K46R菌株的Caspase-8活性显著下降了;K46R菌株的Caspase-9活性显著下降。通过q PCR测定点突变株中exsA和t3ss效应蛋白的m RNA表达量,结果表明,与HY9901

关键词：溶藻弧菌 PhoP 乙酰化修饰 t3ss 毒力

鹦鹉热衣原体t3ss假定蛋白CPSIt0959的鉴定及功能初步研究

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鹦鹉热衣原体T3SS假定蛋白CPSIT0959的鉴定及功能初步研究

作者：文雅婷南华大学

学位级别：硕士

目的:衣原体作为专性胞内寄生病原菌,缺乏有效机制生成一系列包括氨基酸在内的重要代谢产物,需从宿主细胞中获取营养物质以实现自身繁殖。此外,许多革兰阴性病原菌的III型分泌系统(type III secretion system,t3ss)效应蛋白与其致病性... 详细信息

目的:衣原体作为专性胞内寄生病原菌,缺乏有效机制生成一系列包括氨基酸在内的重要代谢产物,需从宿主细胞中获取营养物质以实现自身繁殖。此外,许多革兰阴性病原菌的III型分泌系统(type III secretion system,t3ss)效应蛋白与其致病性有关。本研究对鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)中预测的t3ss蛋白CPSIt959进行鉴定,并对其半胱氨酸脱硫酶活性、时相表达、亚细胞定位及其对衣原体感染和宿主细胞的影响进行了初步研究。这对进一步探索Cps胞内复制的营养来源及感染晚期抗凋亡机制和药物作用靶点提供了新思路。方法:MEGA 5.0绘制CPSIt959进化树,利用紫外分光光度计检测该蛋白在体外的半胱氨酸脱硫酶活性,磷酸吡哆醛(5’-pyridoxal phosphate,PLP)抑制剂硼氢化钠(sodium borohydride,NaBH)和D-环丝氨酸(D-4-amino-3isoxazolidone,DCS)验证该蛋白是否为PLP依赖性酶,圆二色谱(Circular dichroism,CD)进行确证。重组蛋白分别刺激HeLa细胞以及DCS处理后的HeLa细胞,感染Cps后间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)计算包涵体形成单位(Inclusion-forming units,IFU)以检测CPSIt959蛋白对Cps生长的影响。培养HeLa细胞,Cps 6BC感染单层HeLa细胞6、12、18、24、36、48、60h后,收集感染各时间点总RNA和总蛋白,分别利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Rt-qPCR)和免疫印迹分析技术(western blot,wb)检测HeLa细胞中CPSIt959 mRNA和CPSIt959蛋白的内源性时相表达,利用IFA检测该蛋白在HeLa细胞中的定位情况及分泌情况。激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)确定蛋白定位情况。Cps 6BC感染单层HeLa细胞12h后加入50μM t3ss特异性抑制剂INP0007,随后分别收集18、24、36、48、60h样本进行IFA和wb分析,并分别于感染后12、18、24h加入抑制剂,36h收集样本,IFA检测蛋白受抑制剂影响情况。不同浓度重组蛋白刺激细胞,利用IFA检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),wb检测HeLa细胞中Fas、Fas-L、Caspase 3、tBid、Bim、Caspase 8的表达水平。结果:(1)进化树及保守结构域分析表明该蛋白为PLP依赖性的半胱氨酸脱硫酶,体外加入PLP抑制剂NaBH和DCS后吸收峰发生显著偏移,CD结果表明CPSIt959二级结构受PLP影响。(2)重组蛋白刺激HeLa细胞后感染Cps,与对照组相比IFU增加,可逆转DCS引起的IFU下降。(3)Rt-qPCR和wb结果表明,Cps感染HeLa细胞6h后,CPSIt959基因开始转录,12h达到峰值,其蛋白表达于24h左右达到峰值。(4)IFA显示感染24h后,CPSIt959主要分布于衣原体包涵体上,少量分布在HeLa细胞胞浆中,36-60h时从包涵体中释放出来,广泛分布于胞浆中。感染后48h,CLSM断层扫描、MOMP的共同定位同样证明该蛋白定位于胞浆中。(5)使用t3ss抑制剂处理后,各感染时间点包涵体明显减小,CPSIt959定位于包涵体上,不存在胞浆中。该蛋白在感染后12-18h分泌至宿主细胞胞浆中。(6)重组蛋白刺激后HeLa细胞凋亡受体途径中Fas、Fas-L表达无明显变化,Caspase 8的表达水平随时间轻度增加,线粒体途径中宿主细胞凋亡相关蛋白tBid和Bim表达随时间呈递增趋势,MMP下降。结论:***959蛋白与其它致病性衣原体半胱氨酸脱硫酶高度同源,为具有磷酸吡哆醛依赖性的半胱氨酸脱硫酶,可逆转环丝氨酸引起的IFU减少。***959在衣原体胞内生长中期阶段通过t3ss分泌至宿主细胞胞浆中,通过下调tBid和Bim的表达,进而引起MMP下降,诱导宿主细胞凋亡,增加Cps子代数量。

关键词：鹦鹉热衣原体 t3ss 半胱氨酸脱硫酶亚细胞定位

水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统（t3ss）抑制剂的筛选

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水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）抑制剂的筛选

作者：陶辉华南农业大学

学位级别：硕士

稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是一种重要的细菌性病害,能使水稻严重减产,是我国水稻生产上的重要细菌病害之一。传统防治措施主要以抗生素为主,随着抗生素的大量使用,病原细菌抗药性的问题日益严峻。以病原细菌的毒力因子为靶点,在不... 详细信息

稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是一种重要的细菌性病害,能使水稻严重减产,是我国水稻生产上的重要细菌病害之一。传统防治措施主要以抗生素为主,随着抗生素的大量使用,病原细菌抗药性的问题日益严峻。以病原细菌的毒力因子为靶点,在不影响细菌生长的前提下,阻断病原菌对宿主植物的侵染达到防治病害的目的,成为新型抗菌药物筛选及研发的新思路和新途径。t3ss(type III Secretion System)是病原细菌在侵染宿主植物时的关键毒力因子,存在于众多革兰氏阴性病原细菌中。由于具有高度的保守性,而且不是细菌生长的关键因素,因此可以作为新型小分子抑制剂筛选及开发的理想靶标。本研究将t3ss作为靶标,完成了345个化合物的筛选,主要包括植物次生代谢产物、人工合成化合物以及海洋微生物提取物。发现了对t3ss有抑制作用的化合物,进一步的生长曲线测试筛选出对病原菌生长没有影响的化合物CZ-1、CZ-4和CZ-9,III-2、III-3、III-4、III-12和III-14,WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24。非寄主烟草过敏性反应显示CZ-1、CZ-4和CZ-9,III-2、III-3和III-4均能完全抑制HR,III-12和III-14则没有明显的影响,结果说明,CZ-1、CZ-4和CZ-9,III-2、III-3和III-4是通过影响t3ss功能,而非细菌生长,影响了Xoo烟草诱导HR的能力。通过qRt-PCR和转录组测序对其相关作用机制进行了初步的研究,在添加抑制剂的情况下,相关基因均受到良好的抑制,并测试了相关化合物对Xoo在水稻幼苗及成株上致病性的影响。最终筛选得到10个具有良好活性的化合物,它们可能通过HrpG/HrpX调控途径影响了t3ss发挥作用,从而影响了Xoo在水稻上的致病性。这一结果为发展新型t3ss抑制剂及其在细菌病害防控方面提供了理论依据。

关键词：水稻白叶枯病 t3ss 革兰氏阴性细菌小分子抑制剂毒力因子靶标

水稻黄单胞菌t3ss效应分子的鉴别和xopQ1-1基因功能研究

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水稻黄单胞菌T3SS效应分子的鉴别和xopQ1-1基因功能研究

作者：裴俊国南京农业大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病(Baterial leaf streak,BLS)和水稻白叶枯病(Bacterial blight, BB)是我国水稻上的两种重要的细菌病害,其病原菌如同其他革兰氏阴性植物病原菌一样,能够通过t3ss系统分泌一些致病性效应分子进入植物细胞中,从而引起寄... 详细信息

水稻细菌性条斑病(Baterial leaf streak,BLS)和水稻白叶枯病(Bacterial blight, BB)是我国水稻上的两种重要的细菌病害,其病原菌如同其他革兰氏阴性植物病原菌一样,能够通过t3ss系统分泌一些致病性效应分子进入植物细胞中,从而引起寄主植物的产生抗(感)病性。虽然水稻黄单胞菌的全基因组测序已完成,但与水稻互作时t3ss效应分子的种类和数量并不清楚。tsuge、Schechter等研究证明t3SE一般具有以下特征：基因的启动子区域存在hrp调控基因hrpX的作用位点PIP-Box (ttCGC-N15-ttCGC);N-端前50个特定氨基酸组成具有分泌信号：脯氨酸(P)和色氨酸(S)>20%,第三位和第四位其中之一为亮氨酸(L)或脯氨酸(P),前12位没有天冬氨酸(D)和谷氨酸(Q)。本研究根据这些方法获得了120个候选基因,选取了其中的15个做进一步的验证,以avrXa10为报道基因,结果发现PXO-3819通过t3S装置分泌,是t3SE。PXO2065、PXO2774、PXO3819启动子序列含有PIP-BOX (ttCGC-N15-ttCGC),以gfp为报道基因证明PXO2065、PXO2774、PXO3819受HrpX调控表达,Rt-PCR验证也得到一致的结果,这两种报道体系的建立为水稻黄单胞菌新的t3SE的鉴定提供了有效的技术支持。基因组学揭示,Xoo和Xoc中均存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst)中通过t3ss分泌的hopQ1-1同源基因xopQ1-1,但其是否为t3ss效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。本文通过基因敲除技术,获得了水稻黄单胞病菌xopQ1-1基因的突变体。致病性测定结果发现,xopQ1-1基因突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1-1基因突变体在3×108CFU/mL浓度时仍能在烟草上激发过敏反应,但在104CFU/mL时,8天后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1-1基因能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力,同样来至野油菜黄单胞菌(*** pv. campestris)、茄青枯病菌(R. solanacearum GMI1000)、丁香假单胞菌(P. syringae pv. tomato DC3000)的同源基因也可以互补恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。研究发现xopQ1-1的表达受HrpX调控,受hrp诱导培养基和植物细胞来源的信号诱导;蛋白免疫实验揭示XopQ1-1通过t3ss装置进行分泌,能够与HrpF转位蛋白进行互作,转位进入植物细胞中;细胞定位显示,XopQ1-1能够结合在细胞膜和细胞核中。酵母双杂交证明XopQ1-1能够与***和HrpB5蛋白互作;以Xoc的xopQ1-1基因为诱饵,从水稻cDNA文库中获得了与xopQ1-1互作的水稻基因,命名OosXopQ1-1;发现OsXopQ1-1受xopQ1-1诱导表达。以上结果表明,Xop1-1是水稻黄单胞菌的t3SE,在革兰氏阴性植物病原细菌中高度保守,具有相同的功能,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。这为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。

关键词：水稻黄单胞菌 t3ss xopQ1-1 致病性

溶藻弧菌t3ss C-环组分VscQ的功能研究

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溶藻弧菌T3SS C-环组分VscQ的功能研究

作者：武沛文广东海洋大学

学位级别：硕士

溶藻弧菌作为水产养殖主要的革兰氏阴性致病菌,给我国的经济发展造成了巨大的损失。本论文拟从生物学特性、转录水平、细胞毒性和减毒活疫苗四个方面,研究溶藻弧菌t3ss C-环组分Vsc Q的功能。溶藻弧菌C-环组分Vsc Q作为三型分泌系统的... 详细信息

溶藻弧菌作为水产养殖主要的革兰氏阴性致病菌,给我国的经济发展造成了巨大的损失。本论文拟从生物学特性、转录水平、细胞毒性和减毒活疫苗四个方面,研究溶藻弧菌t3ss C-环组分Vsc Q的功能。溶藻弧菌C-环组分Vsc Q作为三型分泌系统的重要组成部分,对溶藻弧菌的致病性产生重要影响。通过同源重组和Overlap PCR技术,采用plp12（CM+）自杀质粒和大肠杆菌β2163结合体系,在野生株溶藻弧菌HY9901基因组上成功框内缺失vscQ基因,获得无抗性的框内缺失株HY9901ΔvscQ。通过对溶藻弧菌HY9901ΔvscQ进行生物学表型研究发现:溶藻弧菌vscQ基因的缺失对生长曲线、生物膜形成能力、胞外蛋白酶活性（ECPsase）的影响不显著,但是溶藻弧菌的泳动能力显著下调（p＜0.01）。斑马鱼的半致死实验表明:C-环组分Vsc Q的缺失使野生株HY9901的毒力下降约4.6倍。应用q Rt-PCR技术研究溶藻弧菌vscQ基因的缺失对野生株转录水平的影响。结果发现:与野生株相比,溶藻弧菌Vsc Q的缺失对t3ss效应蛋白Vop N的转录水平影响不显著,对效应蛋白Va1686及Vop S、装置蛋白Vsc L、Vsc K、Vop B、Vop D、Vcr V、分子伴侣Vsc O与AtPase Vsc N的转录水平均有显著影响,同时显著下调鞭毛蛋白Fla A与鞭毛形成蛋白Fli G转录水平（p＜0.01）。HY9901ΔvscQ感染鲤鱼上皮细胞FHM发现:缺失株感染后显著降低细胞Caspase-3的活性（p＜0.01）,表明Vsc Q蛋白参与溶藻弧菌致细胞凋亡过程。同时,伴随着细胞大量死亡,LDH和NO的释放量显著降低（p＜0.01）。这表明蛋白Vsc Q参与溶藻弧菌侵染细胞过程,它的缺失降低了溶藻弧菌对鱼类细胞的毒性。应用HY9901ΔvscQ作为减毒活疫苗免疫斑马鱼四周后,用强毒株HY9901进行攻毒实验,对照组的死亡率为57.7%,而免疫组的死亡率仅为16.3%,相对免疫保护率RPS为71%。通过对ΔvscQ感染后的肝脏和脾脏细菌定量实验发现,ΔvscQ在免疫第二天时细菌量达到最大,随后逐渐减少,在第八天被机体清除。免疫四周后,与PBS对照组相比,ΔvscQ免疫组能显著增强脾脏和肝脏中免疫相关基因tNF-α、tLR5、IL-6R、Ig M和c/ebpβ的表达水平（p＜0.01）。这些结果表明缺失株HY9901ΔvscQ可以作为一种有效的减毒活疫苗拮抗溶藻弧菌感染,同时为减毒活疫苗候补菌株HY9901ΔvscQ提供了理论依据。

关键词：溶藻弧菌 t3ss vscQ 减毒活疫苗