溶藻弧菌PhoP的赖氨酸乙酰化修饰对T3SS致病性的影响机制

作     者：王俊霖 

作者单位：广东海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：庞欢瑛

授予年度：2023年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：溶藻弧菌 PhoP 乙酰化修饰 T3SS 毒力 

摘      要：溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引发海水经济动物弧菌病的主要病原之一,Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system,T3SS）与溶藻弧菌的毒力密切相关。ExsA是T3SS的核心调控蛋白,可直接诱导效应蛋白的分泌,进而致宿主细胞死亡。另外还存在全局调节因子,可调控ExsA进而间接调控T3SS的分泌。蛋白翻译后修饰（Post-translational modifications,PTMs）是病原菌致病性的调控热点,研究已发现溶藻弧菌的一些全局调控因子具有乙酰化修饰（Kac）。据此,本论文结合蛋白质乙酰化修饰组学和分子生物学技术,研究全局调控因子的乙酰化修饰对溶藻弧菌毒力的影响,旨在揭示乙酰化修饰对细菌T3SS致病性的影响机制,为更好地预防和控制弧菌病提供靶点。主要结果如下: （1）为筛选溶藻弧菌HY9901 T3SS的调控因子,构建了T3SS诱导（HY9901:pexsA）和非诱导（HY9901:pexsD）菌株。利用4D非标定量蛋白质组学技术鉴定HY9901:pexsA和HY9901:pexsD的全菌蛋白赖氨酸乙酰化修饰水平,对差异修饰蛋白进行了生物信息学分析。结果发现:与T3SS非诱导株相比,T3SS诱导株共有461个蛋白的表达发生了变化,其中229个蛋白的表达显著上调,232个蛋白的表达显著下调;共有564个蛋白的Kac位点发生变化,其中271个修饰位点上调,293个修饰位点下调。这些差异修饰蛋白主要涉及细胞、代谢过程、核糖体和转录相关。基序分析发现有23个赖氨酸乙酰化修饰保守基序,其中出现频率最高的是RKac S（571次）,出现频率最低的是EKac（43次）。从上述乙酰化修饰差异显著的蛋白中,选取全局调节因子PhoP为研究对象,分析发现其在K189处具有Kac修饰位点。 （2）对PhoP进行基因克隆、生物信息学分析、原核表达以及乙酰化修饰验证。结果表明:phoP基因全长为732 bp,功能结构域预测表明其具有REC和Trans reg＿C结构域,三维结构分析发现其与结核分歧杆菌PhoP单亚基Reg X3结构相似。成功构建原核表达载体pGEX-4T-phoP并纯化,免疫小鼠得到鼠抗PhoP抗体,利用IP和Western blot技术,证明溶藻弧菌HY9901的PhoP天然蛋白和重组蛋白均具有Kac修饰,通过结合胶内酶解和高分辨生物质谱技术鉴定pGEX-4T-phoP重组蛋白在K46处具有Kac修饰位点。 （3）采用Overlap PCR和同源重组技术成功构建了溶藻弧菌HY9901ΔphoP缺失株,并对其进行生物学表型和转录组测序分析。结果表明,phoP基因的缺失,对菌株的生长、胞外蛋白酶活性的表达无显著影响,但是显著下调了生物膜形成能力（0-6 h）、泳动能力和毒力。药敏试验结果表明相较于野生株,缺失株ΔphoP对头孢他啶、头孢咪唑的敏感性增强,但对头孢拉定、氨基糖苷类的抗生素敏感性减弱。比较转录组学结果表明:与HY9901相比,?phoP共有533个基因的表达发生显著变化,其中291个基因上调,242个基因下调。GO功能富集表明差异表达基因主要与合成相关,其次是核糖体。KEGG通路分析表明主要差异表达基因集中在双组份系统、核糖体、氨基酸生物合成。通过q PCR验证差异基因和T3SS的关系,发现ΔphoP中T3SS调控蛋白exsA和效应蛋白hop Pma J、vop N、vcr V、vop S基因的m RNA表达显著下调,证实转录组数据准确可靠。 （4）在获得了回补株C-phoP的基础上,利用快速定点突变技术,将PhoP乙酰化修饰位点K189和K46的赖氨酸（K）分别突变成精氨酸（R,模拟去乙酰化修饰）、谷氨酰胺（Q,模拟乙酰化修饰）、丙氨酸（A,模拟该位点既不能乙酰化和也不能去乙酰化）。采用SWISS-MODEL预测位点突变对PhoP蛋白结构的影响,探究各乙酰化修饰位点的突变对胞外蛋白酶活性、斑马鱼存活能力和细胞毒性的影响。结果表明:SWISS-MODEL预测显示不同修饰位点的突变可引起PhoP蛋白空间结构产生不同程度的变化;与HY9901相比,K189、K46位点的突变对胞外蛋白酶活性影响不显著;K189R株对斑马鱼的毒力显著上升,而K189Q、K46R、K46A株的毒力显著下降,K46Q株的毒力与HY9901持平;FHM细胞感染试验发现,与HY9901相比,K189R株感染细胞后,Caspase-3和LDH的活性显著上升,而K189Q株的Caspase-3活性显著减弱;K189Q、K46R菌株的Caspase-8活性显著下降了;K46R菌株的Caspase-9活性显著下降。通过q PCR测定点突变株中exsA和T3SS效应蛋白的m RNA表达量,结果表明,与HY9901