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应用southern印迹杂交法检测转移基因在宿主细胞中的整合

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苏州医学院学报 2001年第2期21卷 114-116页

作者：阳小卫王玮夏学鸣陈子兴苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所苏州215006

目的　应用southern印迹杂交法 (southernblot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法　酚氯仿法提取基因转导的PA317/AIM及K5 6 2 /AIM细胞基因组DNA ,以聚合酶链反应 (PCR)扩增转移基因片段 ;随机引物法标记3 2 P -DNA探针 ,与经... 详细信息

目的　应用southern印迹杂交法 (southernblot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法　酚氯仿法提取基因转导的PA317/AIM及K5 6 2 /AIM细胞基因组DNA ,以聚合酶链反应 (PCR)扩增转移基因片段 ;随机引物法标记3 2 P -DNA探针 ,与经BamHI酶切、琼脂糖凝胶电泳、转移至尼龙膜的基因组DNA进行southern杂交反应 ,检测转移基因的整合。结果　PCR反应和southernblot分析证实转移基因存在于受体细胞基因组DNA中。结论　southern印迹杂交法证实转移基因稳定整合至逆转录病毒生产细胞PA317/AIM及靶细胞K5 6 2 /AIM中。

关键词： southern印迹杂交聚合酶链反应转移基因基因组肿瘤基因治疗宿主细胞

院内肺炎逆行感染途径的southern印迹杂交分析

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中华医院感染学杂志 2003年第4期13卷 5-8页

作者：代芊周涌宁涛李剑峰李冰黄汉朝第四军医大学吉林军医学院军卫教研室第四军医大学吉林军医学院附属医院第四军医大学吉林军医学院附属医院吉林132013

目的　为确证胃→咽→下呼吸道逆行感染途径存在与否 ,研究胃液 pH值变化与医院感染性肺炎 (NP)发生的关系。方法　以气管切开 (或插管 )患者为研究对象 ,用防污染标本刷 (PSB)采集标本 ,由细菌表型分型 ,直至质粒DNA、酶切、southern... 详细信息

目的　为确证胃→咽→下呼吸道逆行感染途径存在与否 ,研究胃液 pH值变化与医院感染性肺炎 (NP)发生的关系。方法　以气管切开 (或插管 )患者为研究对象 ,用防污染标本刷 (PSB)采集标本 ,由细菌表型分型 ,直至质粒DNA、酶切、southern印迹杂交等基因分型 ,前瞻性观察NP的发生情况。结果　 11名患者有逆行感染存在 (发生率 2 2 %) ,应用质粒图谱、酶切图谱和southern印迹杂交等分子生物学技术进行同源性分析 ,证明其有很高的同源性。结论　存在胃→咽→下呼吸道逆行感染途径 ,NP的发生与胃液 pH值显著相关。

关键词： southern印迹杂交医院感染性肺炎(NP) 逆行感染

犬贾第虫端粒重复序列的southern印迹杂交分析

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中国病原生物学杂志 2008年第3期3卷 183-185页

作者：刘成武张西臣李建华刘慧宫鹏涛张国才吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

目的确定犬贾第虫端粒DNA的重复序列,为进行端粒酶活性检测奠定基础。方法根据已发表的蓝氏贾第虫的端粒重复序列5′-TAGGG-3′设计寡聚核苷酸探针(TAGGG)5,并以地高辛标记,将犬贾第虫基因组DNA经Bal31-EcoRⅠ酶切后,进行southern印迹... 详细信息

目的确定犬贾第虫端粒DNA的重复序列,为进行端粒酶活性检测奠定基础。方法根据已发表的蓝氏贾第虫的端粒重复序列5′-TAGGG-3′设计寡聚核苷酸探针(TAGGG)5,并以地高辛标记,将犬贾第虫基因组DNA经Bal31-EcoRⅠ酶切后,进行southern印迹杂交分析。结果犬贾第虫基因组DNA与探针(TAGGG)5杂交,获得了较好的杂交条带,随Bal31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱。结论犬贾第虫端粒重复序列定位在染色体的末端序列与国外报道的贾第虫端粒重复序列一致,为5′-TAGGG-3′。

关键词：犬贾第虫端粒DNA southern印迹杂交

SYBR Green I荧光检测痕量宿主DNA

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东北农业大学学报 2011年第7期42卷 125-129页

作者：蔺芳付瑞敏皮川真时凯叶刚江景玉陈慧珍新乡学院生命科学与技术系河南新乡453000 河南教育学院人口与生命科学系郑州450046 邦和药业股份有限公司郑州450001

基于SYBR Green I荧光染料与双链DNA结合产生荧光的原理,建立一种痕量DNA荧光检测方法。采用不同稀释倍数的SYBR Green I荧光染料做DNA的标准曲线,确定SYBR Green I荧光染料的最佳稀释倍数。比较荧光法和southern blotting杂交法定量DN... 详细信息

基于SYBR Green I荧光染料与双链DNA结合产生荧光的原理,建立一种痕量DNA荧光检测方法。采用不同稀释倍数的SYBR Green I荧光染料做DNA的标准曲线,确定SYBR Green I荧光染料的最佳稀释倍数。比较荧光法和southern blotting杂交法定量DNA。结果表明,SYBR Green I荧光染料稀释倍数为1∶10 000时线性范围广,线性关系好(R2=0.9999);荧光法和southern blotting杂交法可以相互印证。由此可知,SYBR Green I荧光法定量DNA是一种快速、稳定的痕量DNA检测方法。

关键词：痕量DNA SYBR Green I 荧光法 southern印迹杂交

柔嫩艾美耳球虫端粒DNA重复序列的South-ern印迹杂交分析

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吉林农业大学学报 2010年第2期32卷 205-208页

作者：杨桂连李建华张西臣赵权宫鹏涛蔡亚南吉林大学畜牧兽医学院长春130062 吉林农业大学动物科学技术学院长春130118

为进一步确定柔嫩艾美耳球虫(***)端粒DNA的重复序列,为下一步端粒酶活性检测奠定基础,根据已克隆发表的***端粒DNA重复序列信息,设计了由4个端粒重复序列串联的寡聚核苷酸探针(TTTAGGG)4,并以生物素地高辛标记。将该探针与经BAL31-Eco... 详细信息

为进一步确定柔嫩艾美耳球虫(***)端粒DNA的重复序列,为下一步端粒酶活性检测奠定基础,根据已克隆发表的***端粒DNA重复序列信息,设计了由4个端粒重复序列串联的寡聚核苷酸探针(TTTAGGG)4,并以生物素地高辛标记。将该探针与经BAL31-EcoRⅠ酶切后的***基因组DNA进行southern印迹杂交分析。结果显示:***基因组DNA与探针杂交获得了清晰的杂交条带,随BAL31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,进一步证明了***端粒DNA重复序列为5-′TTTAGGG-3′,且此重复序列在***染色体的末端。

关键词：柔嫩艾美耳球虫端粒DNA southern印迹杂交

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转碱蓬脱水素基因烟草的鉴定和功能分析

转碱蓬脱水素基因烟草的鉴定和功能分析

作者：孙檬沈阳农业大学

学位级别：硕士

本研究以转碱蓬脱水素基因(DHN)的烟草、野生型烟草为材料,分别在DNA分子水平,蛋白表达水平及生理水平对转基因植株进行了检测,以期获得可遗传的转碱蓬脱水素基因(DHN)植株,为进一步研究该基因的功能及机制提供可靠的材料。转碱蓬脱水... 详细信息

本研究以转碱蓬脱水素基因(DHN)的烟草、野生型烟草为材料,分别在DNA分子水平,蛋白表达水平及生理水平对转基因植株进行了检测,以期获得可遗传的转碱蓬脱水素基因(DHN)植株,为进一步研究该基因的功能及机制提供可靠的材料。转碱蓬脱水素基因烟草分子水平上的鉴定主要包括PCR检测和southern印迹杂交检测。提取转基因烟草、野生型烟草的总DNA,PBI121-DNH-农杆菌质粒,以PBI121-DNH-农杆菌质粒为阳性对照,以野生型烟草总DNA为阴性对照。在脱水素特异性引物的作用下进行PCR检测。PCR检测出6株阳性转脱水素基因烟草。但PCR检测可能出现假阳性结果,故进一步进行了southern印迹杂交试验。以标记的PBI121-DNH-农杆菌质粒为探针,与阳性对照、阴性对照、转基因烟草总DNA杂交,采用酶联免疫CSPD的方法对杂交信号显色。显色结果表明经PCR检测的6株阳性转基因烟草均有明显的杂交信号,说明脱水素基因成功的导入烟草基因组中。转碱蓬脱水素基因烟草蛋白表达水平上的鉴定主要进行了原核表达、聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western印记杂交检测。提取经PCR和southern检测的阳性转基因烟草、野生型烟草的总蛋白,PET28b-SsDHN-大肠杆菌BL21表达蛋白,以pET28b-SsDHN-大肠杆菌BL21表达蛋白为阳性对照,以野生型烟草总蛋白为阴性对照。通过聚丙烯酰氨凝胶电泳分离不同分子量的蛋白,根据脱水素蛋白理论分子量27KD筛选出脱水素蛋白条带,电泳结果表明6株烟草均在27KD处有条带,说明脱水素蛋白可能成功表达。再与脱水素多克隆抗体(一抗)杂交,“脱水素——抗”结合物与碱性磷酸酶标记的二抗杂交,采用BCIP/NBT方法检测杂交信号。检测结果表明27KD处的蛋白条带均有杂交信号,说明6株转基因烟草均表达了脱水素蛋白。转碱蓬脱水素基因烟草的生理功能分析主要包括相对电导率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、游离脯氨酸含量四个指标。随着盐浓度的增加,转基因烟草和野生型烟草的相对电导率、丙二醛含量均增加,但在相同的盐浓度下,转基因烟草相对电导率、丙二醛含量低于野生型烟草;转基因烟草的超氧化物歧化酶活性一直在升高,而野生型烟草的超氧化物歧化酶活性先升高后降低，且在同一盐浓度下,转基因烟草超氧化物歧化酶活性高于野生型烟草;转基因烟草和野生型烟草的游离脯氨酸含量均先升高后降低,但在同一盐浓度下转基因烟草游离脯氨酸含量高于野生型烟草。结果表明转基因烟草的耐盐性优于野生型烟草,说明转碱蓬脱水素基因的烟草具有耐盐性功能。

关键词：脱水素烟草 southern印迹杂交 Western印记杂交生理功能

对我国遗传性牙龈纤维瘤病SOS1基因的研究

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对我国遗传性牙龈纤维瘤病SOS1基因的研究

作者：张鹏吉林大学

学位级别：硕士

遗传性牙龈纤维瘤病(hereditary gingival fibromatosis,HGF)是一种罕见的牙龈组织弥漫性,渐进性增生为特征的良性病变。多有家族史也可散发,多为常染色体显性遗传,也有隐性遗传的报道。由于病因不明,治疗多以外科手术切除为主,但术后... 详细信息

遗传性牙龈纤维瘤病(hereditary gingival fibromatosis,HGF)是一种罕见的牙龈组织弥漫性,渐进性增生为特征的良性病变。多有家族史也可散发,多为常染色体显性遗传,也有隐性遗传的报道。由于病因不明,治疗多以外科手术切除为主,但术后易复发。给患者带来了极大的痛苦。近年来随着人类基因组计划的不断发展,关于HGF的致病基因的研究已有所进展。但由于HGF遗传基因存在着明显的遗传异质性,对其致病基因的定位有待进一步的研究。本实验我们采用southern印迹杂交的方法对我国现有的两个家族遗传性牙龈纤维瘤病家系进行国外已证实的已知基因突变位点——SOS1(son of sevenless 1,SOS1)基因21号外显子的排除性定位。其结果表明:(1)SOS1基因的21号外显子都存在并没有缺失,并且其中没有较大片段的插入或缺失。(2)发现有典型临床症状者13人中有5例存在着Hart等已证实的SOS1基因突变(第126,142和126,143位核苷酸间有一胞嘧啶插入),而其余8人未发现这一突变。剩余9个无典型临床症状和11个正常对照样品中则不存在这一突变。因此可得出结论:我国两家系HGF中虽然存在国外已证实的SOS1基因21号

关键词：遗传性牙龈纤维瘤病 SOS1基因 southern印迹杂交点突变

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糙皮侧耳***基因超表达载体的构建及转化研究

作者：黄茜华中农业大学

学位级别：硕士

真菌疏水蛋白是一类具有强农面活性的分泌型小分子量蛋白质,是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类特殊的蛋白质,它同时具有亲水和疏水结构,当遇到两相界面时能自我装配成两亲性薄膜。真菌疏水蛋白在真菌生长发育的一些特殊时期会高度表达... 详细信息

真菌疏水蛋白是一类具有强农面活性的分泌型小分子量蛋白质,是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类特殊的蛋白质,它同时具有亲水和疏水结构,当遇到两相界面时能自我装配成两亲性薄膜。真菌疏水蛋白在真菌生长发育的一些特殊时期会高度表达,具有特定的生物学功能,可被应用于食品、医疗等许多领域。因此,研究疏水蛋白基因具有重要意义。本研究构建了糙皮侧耳子实体特异疏水蛋白基因***的超表达Ti载体pPHOEx,利用根癌农杆菌转化野生型菌丝得到转化子,并对转化子进行检测和分析,具体研究结果如下：1、成功构建了***超表达Ti载体pPHOEx,并进行转化,筛选得到12个拟转化子;2、利用特异PCR检测12个拟转化子,其中7个转化子检测结果呈阳性,将这7个转化子分别命名为G1～G7;3、对转化子进行southern杂交分析,结果显示T-DNA在转化子中均为单拷贝的随机整合;4、对转化子进行RAPD分析,13个随机引物共检测到111个位点,其中多态位点有44个,多态位点比率为39.64%,DNA多态性指数为56.63;5、对转化子进行实时定量PCR分析,转化子菌丝中基因***的表达量有不同程度的增加;6、对转化子进行同工酶分析,结果为：转化子的酯酶与过氧化物酶谱带都存在一定的差异;7、荧光显微镜镜检结果显示,所有的转化子菌丝都可以观察到绿色荧光蛋白的表达;8、转化子菌丝的生长速度不同,子实体的形态也有一些差异;9、利用SEFA-PCR成功克隆得到子实体特异疏水蛋白基因***的启动子序列。

关键词：疏水蛋白超表达转化 southern印迹杂交随机扩增多态性DNA标记同工酶

乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达鉴定、发酵工艺优化及发酵液后处理的研究

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乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达鉴定、发酵工艺优化及发酵液后处理...

作者：苏全内蒙古农业大学

学位级别：硕士

β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.***.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶可将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖,同时也具有半乳糖苷的转移作用。β-半乳糖苷酶主要应用在生产低乳糖乳制品以及缓解绝大... 详细信息

β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.***.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶可将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖,同时也具有半乳糖苷的转移作用。β-半乳糖苷酶主要应用在生产低乳糖乳制品以及缓解绝大多数亚洲人食用乳制品时造成的乳糖吸收不良和乳糖不耐受的问题。但目前在我国乳糖酶的应用还未得到广泛推广,主要原因就是乳糖酶产量低,销售价格过高,应用成本昂贵,不能满足食品和乳制品工业的需要。而基因工程技术的发展,为研制出产量高、酶学性质优良、工艺简便、成本低、更适合食品工业生产的乳糖酶提供了有效的途径。本试验利用基因工程技术,构建真核表达载体pPIC9-cDNA,并且利用毕赤酵母表达系统成功的高效分泌表达了来源于亮白曲霉的乳糖酶,表达量达6g/L。在此基础上对高表达菌株的插入位点进行了鉴定,结果显示1#、7#初步认为整合方式相同,并且与25#整合方式不同,这为寻找高表达的菌株与插入位点之间的关系,为获得高表达菌株奠定理论基础。同时在小试水平对乳糖酶的发酵工艺进行了研究和优化,成功的摸索出乳糖酶发酵的最佳条件为10%接种量,温度30℃,pH5.2,菌体生长时间24～28h,甲醇添加量由DO控制,诱导方式首先采取了葡萄糖-甲醇混合物进行过渡期,随后是甲醇诱导的方式,这将为乳糖酶大规模工业化生产提供借鉴。最后,根据乳糖酶发酵液中颜色较深,盐浓度高等特点和后期纯化工艺的要求,选择了膜分离技术来处理发酵液,其中主要从微滤提取、超滤浓缩两步操作过程对酶活性的影响进行了研究,就超滤而言,温度25℃,操作压力小于0.12MPa,浓缩倍数10倍时,酶活损失最少,膜最容易清洗。

关键词：乳糖酶巴斯德毕赤酵母聚合酶链式反应 southern印迹杂交发酵膜技术