糙皮侧耳***基因超表达载体的构建及转化研究

作     者：黄茜 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马爱民

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0902[农学-园艺学] 090102[农学-作物遗传育种] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：疏水蛋白 超表达 转化 Southern印迹杂交 随机扩增多态性DNA标记 同工酶 

摘      要：真菌疏水蛋白是一类具有强农面活性的分泌型小分子量蛋白质,是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类特殊的蛋白质,它同时具有亲水和疏水结构,当遇到两相界面时能自我装配成两亲性薄膜。真菌疏水蛋白在真菌生长发育的一些特殊时期会高度表达,具有特定的生物学功能,可被应用于食品、医疗等许多领域。因此,研究疏水蛋白基因具有重要意义。 本研究构建了糙皮侧耳子实体特异疏水蛋白基因***的超表达Ti载体pPHOEx,利用根癌农杆菌转化野生型菌丝得到转化子,并对转化子进行检测和分析,具体研究结果如下： 1、成功构建了***超表达Ti载体pPHOEx,并进行转化,筛选得到12个拟转化子;2、利用特异PCR检测12个拟转化子,其中7个转化子检测结果呈阳性,将这7个转化子分别命名为G1～G7;3、对转化子进行Southern杂交分析,结果显示T-DNA在转化子中均为单拷贝的随机整合;4、对转化子进行RAPD分析,13个随机引物共检测到111个位点,其中多态位点有44个,多态位点比率为39.64%,DNA多态性指数为56.63;5、对转化子进行实时定量PCR分析,转化子菌丝中基因***的表达量有不同程度的增加;6、对转化子进行同工酶分析,结果为：转化子的酯酶与过氧化物酶谱带都存在一定的差异;7、荧光显微镜镜检结果显示,所有的转化子菌丝都可以观察到绿色荧光蛋白的表达;8、转化子菌丝的生长速度不同,子实体的形态也有一些差异;9、利用SEFA-PCR成功克隆得到子实体特异疏水蛋白基因***的启动子序列。