检索结果-南通市图书馆

猪链球菌2型分选酶srtBCD基因敲除株的构建及其生物学特性分析

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微生物学报 2011年第3期51卷 386-392页

作者：陈红娜廖辉王长军潘秀珍唐家琪南京军区军事医学研究所南京210002 南京医科大学基础医学院南京210029

【目的】阐明分选酶srtBCD基因在猪链球菌2型致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为壮观霉素、两侧为srtBCD基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,筛选srtBCD缺失的突变株,并通过组合PCR和... 详细信息

【目的】阐明分选酶srtBCD基因在猪链球菌2型致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为壮观霉素、两侧为srtBCD基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,筛选srtBCD缺失的突变株,并通过组合PCR和逆转录PCR对其进行验证。生物学功能实验研究srtBCD突变株和野毒株05Z33在生长速率、粘附、毒力等方面的差异。【结果】组合PCR和逆转录PCR结果均证实srtBCD突变株构建成功,体外实验结果显示srtBCD缺失后细菌的生长速率减慢,与Hep-2上皮细胞的粘附率明显降低,小鼠毒力实验数据表明突变株毒力无明显变化。【结论】猪链球菌2型srtBCD基因与细菌的粘附能力有关,为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。

关键词：猪链球菌2型 sortase BCD 基因敲除粘附毒力

咖啡酸通过抑制分选酶A治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠

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吉林农业大学学报 2016年第3期38卷 336-340,345页

作者：毕重伟王琳王大成吉林大学动物科学学院长春130062

利用荧光共振能量转移试验(FRET),测定咖啡酸对金黄色葡萄球菌分选酶A(sortase A,Srt A)的抑制作用;利用蛋白结合试验,验证咖啡酸通过抑制sortase A的活性影响金葡菌黏附于纤维蛋白原;通过构建小鼠腹膜炎模型,观察咖啡酸对金葡菌引起感... 详细信息

利用荧光共振能量转移试验(FRET),测定咖啡酸对金黄色葡萄球菌分选酶A(sortase A,Srt A)的抑制作用;利用蛋白结合试验,验证咖啡酸通过抑制sortase A的活性影响金葡菌黏附于纤维蛋白原;通过构建小鼠腹膜炎模型,观察咖啡酸对金葡菌引起感染的治疗作用。结果表明:咖啡酸对sortase A活性有明显的抑制作用,咖啡酸质量浓度为256μg/m L时,抑制率达到88.90%,IC_(50)为(37.13±4.55)μg/m L;咖啡酸对金葡菌的黏附有一定的抑制作用,当咖啡酸质量浓度为256μg/m L时,黏附率为18.77%;咖啡酸对金葡菌引起的腹膜炎有一定的治疗作用,给药组小鼠脓肿程度降低,腹腔载菌量显著减少。这说明咖啡酸可能成为金葡菌感染治疗药物研发的先导化合物。

关键词：金黄色葡萄球菌 sortase A 咖啡酸腹膜炎

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒表面抗原密度对抗体应答水平的影响

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微生物学报 2019年第2期59卷 303-313页

作者：李琪汤书兵周树敏钱志康上海大学生命科学学院上海200000 中国科学院上海巴斯德研究所中国科学院分子病毒与免疫重点实验室上海200000

【目的】为了探究乙肝病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)表面抗原密度对免疫后抗体应答水平的影响,制备了不同抗原密度的HBc VLPs疫苗,并检测了其在小鼠体内的抗体应答水平。【方法... 详细信息

【目的】为了探究乙肝病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)表面抗原密度对免疫后抗体应答水平的影响,制备了不同抗原密度的HBc VLPs疫苗,并检测了其在小鼠体内的抗体应答水平。【方法】首先制备了N端带有3个甘氨酸的人巨细胞病毒重组抗原域AD-4作为模式抗原,接着通过sortase A的介导将AD-4连接到HBc VLPs表面上。将系列浓度梯度AD-4抗原在sortaseA介导下分别与相同浓度的HBcVLPs发生反应,制备不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs。将其分别免疫6–8周龄BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔2 w,间接ELISA法检测被免疫小鼠血清的抗体应答水平。【结果】结果表明,当HBc VLPs表面抗原密度为44.4%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:0.5时,不足以引起高滴度的抗体产生;当HBc VLPs表面抗原密度为64.2%时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1:1时,HBc-AD-4 VLPs诱导的AD-4特异性抗体滴度与100%抗原密度的HBc-AD-4VLPs所引起的抗体滴度相当;当HBcVLPs表面抗原密度大于64.2%时,引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而进一步增强。【结论】发现了HBcVLPs表面抗原密度与免疫后抗体滴度呈正相关,然而免疫64.2%抗原密度的HBc VLPs所产生的抗体滴度可达峰值,抗原密度进一步增加,抗体应答水平不会进一步加强。

关键词：病毒样颗粒抗原密度体液免疫乙肝病毒核心蛋白 sortase A

猪链球菌2型05ZYH33强毒株srt同源序列及srtA原核表达抗原性的分析

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第5期23卷 399-401,405页

作者：董亚青王长军郑峰潘秀珍范红结唐家琪南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所江苏南京210002 南京军区军事医学研究所

目的阐明猪链球菌(***)2型人源强毒力株05ZYH33基因组中srt的数量和分布,原核表达srtA,并分析表达产物的抗原性。方法借助生物信息学软件对05ZYH33基因组中sortase及其相关家族蛋白进行同源性分析,克隆srtA基因,表达的重组蛋白用Western... 详细信息

目的阐明猪链球菌(***)2型人源强毒力株05ZYH33基因组中srt的数量和分布,原核表达srtA,并分析表达产物的抗原性。方法借助生物信息学软件对05ZYH33基因组中sortase及其相关家族蛋白进行同源性分析,克隆srtA基因,表达的重组蛋白用Western blot检测其抗原活性,制备sortase鼠多抗血清,间接ELISA检测鼠多抗血清的滴度。结果通过系统的搜索和分析,发现05ZYH33基因组中含有6个sortase的同源性序列,其中SrtA及sortase-like归属sortase家族中的A组,SrtBCD和SrtE属B组。srtA基因在原核细胞中得到高效表达,表达产物可与***2型的兔多抗血清发生特异性的反应。以重组蛋白为免疫原制备的多抗血清效价达1∶6400。结论我国***2型强毒力株05ZYH33含有6个srt基因,与国外报道相比新发现一个sortase-like基因。srtA基因可在原核系统高效表达,重组蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究sortase功能奠定了基础。

关键词：猪链球菌 sortase 克隆

猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性

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中国兽医学报 2009年第10期29卷 1293-1298页

作者：吴涛常海涛谭臣付婷司有辉贝为成陈焕春武汉工业学院动物科学与营养工程学院湖北武汉430023 华中农业大学农业微生物国家重点实验室湖北武汉430070

扩增了srtA基因的上、下游同源臂P1和P2及其全长序列,利用温度敏感型"自杀性"质粒pSET4s构建了重组质粒pSET4s-P1-P2,并将该质粒电转化入野生菌株SS2(SC21)中,通过抗生素和温度双重筛选,得到srtA基因缺失菌株,命名SC211。同时,将srtA基... 详细信息

扩增了srtA基因的上、下游同源臂P1和P2及其全长序列,利用温度敏感型"自杀性"质粒pSET4s构建了重组质粒pSET4s-P1-P2,并将该质粒电转化入野生菌株SS2(SC21)中,通过抗生素和温度双重筛选,得到srtA基因缺失菌株,命名SC211。同时,将srtA基因定向插入穿梭质粒pAT18,构建穿梭质粒pAT18-srtA,并将该质粒电转入srtA基因缺失菌株SC211中,通过抗生素筛选,得到质粒介导的srtA基因互补菌株SC212。通过PCR、South-ern blotting等对缺失突变菌株和互补菌株进行了鉴定。对基因缺失突变菌株和回复菌株传代培养遗传稳定性试验结果显示,缺失突变菌株和互补菌株能够稳定遗传。比较了基因缺失突变菌株、互补菌株及野生菌株的生长特性、溶血活性、细胞粘附特性,结果表明,3个菌株的生长速度、溶血活性没有明显差异。基因缺失后SS2对Hep2细胞的粘附能力明显下降,只有野毒菌株的49%,互补菌株粘附能力几乎达到野毒菌株的水平,是野毒菌株的89%。CD1小鼠毒力试验结果显示,srtA基因缺失株SC211的LD50(4.93×107)约为野毒菌株SC21的LD50(8.21×106)的6倍,质粒介导的互补菌株SC212的LD50(1.43×107)是野生菌株SC21的1.7倍,接近野毒菌株的水平,说明srtA基因缺失后SS2毒力显著下降。

关键词：猪2型链球菌 sortase A 基因缺失茵株互补菌株粘附

2型猪链球菌SrtA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国病原生物学杂志 2017年第12期12卷 1144-1147页

作者：丁晨曦艾乐乐龚秀芳胡丹陈家锋郭晓璐潘秀珍王长军第三军医大学军事预防医学院重庆400038 南京军区军事医学研究所

目的制备并鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,*** 2)强毒株05ZYH33分选酶A(sortase A,SrtA)的单克隆抗体。方法 PCR扩增2型猪链球菌05ZYH33菌株基因组SrtA全长,构建表达质粒pETDuet-1/SrtA,导入*** BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达SrtA蛋白,柱纯化后免疫BALB/c雌鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,收集培养上清并制备小鼠腹水,采用Western blot单克隆抗体特异性,ELISA检测单抗效价。结果筛选到1株能持久、稳定分泌抗SrtA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,标记为1F5,抗体亚型为IgM型/κ链;Western blot显示该抗体能识别SrtA蛋白。结论成功制备分泌抗SrtA蛋白的杂交瘤细胞株,制备的单抗效价高,为研究2型猪链球菌感染致病过程中SrtA的作用奠定了基础。

关键词： 2型猪链球菌 sortase A 原核表达单克隆抗体

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组氨酸三聚体蛋白在2型猪链球菌的定位

临床检验杂志 2009年第6期27卷 450-452页

作者：邵珠卿潘秀珍韩明月李先富秦跃红王长军唐家琪南京军区疾病预防控制中心南京210002 南京师范大学生命科学学院南京210046

目的研究组氨酸三聚体蛋白(histidine triad protein,Htp)在2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,*** 2)05ZYH33中的定位,以及sortase A(srtA)基因缺失对该蛋白表达的影响。方法通过生物软件分析Htp氨基酸序列的分子特征;以纯化的Htp重组... 详细信息

目的研究组氨酸三聚体蛋白(histidine triad protein,Htp)在2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,*** 2)05ZYH33中的定位,以及sortase A(srtA)基因缺失对该蛋白表达的影响。方法通过生物软件分析Htp氨基酸序列的分子特征;以纯化的Htp重组蛋白为免疫原,免疫新西兰兔,获得兔抗Htp抗血清;利用western blotting和ELISA检测该抗体的特异性和效价;以抗Htp抗体为工具通过流式细胞术验证Htp在菌体表面的定位,并比较05ZYH33和srtA基因敲除突变株△srtA菌体表面Htp的表达量。结果生物软件预测发现Htp存在信号肽和跨膜序列,具备表面蛋白的特征;流式细胞分析发现Htp定位于*** 2表面;△srtA菌体表面Htp的量明显少于野生型菌株。结论本研究明确了Htp在*** 2菌体表面的定位并发现srtA基因敲除后细菌表面的Htp有所减少,为进一步研究Htp在猪链球菌致病过程中发挥的功能及其调控机制奠定了基础。

关键词：组氨酸三聚体蛋白流式细胞术定位 sortase A

猪链球菌2型强毒株srtA基因缺失株的构建及其毒力分析

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猪链球菌2型强毒株srtA基因缺失株的构建及其毒力分析

作者：董亚青南京农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌2型(Streplococcus suis type 2，SS2)是危害养猪业的重要病原菌，同时也给从业人员带来严重的威胁。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原性的不同，可将其分为35个血清型(1～34，1／2)。主要致病血清型为SS1、SS2... 详细信息

猪链球菌2型(Streplococcus suis type 2，SS2)是危害养猪业的重要病原菌，同时也给从业人员带来严重的威胁。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原性的不同，可将其分为35个血清型(1～34，1／2)。主要致病血清型为SS1、SS2、SS1╱2、SS7、SS9和SS14，其中以SS2流行最广、致病性最强。已知的与致病性相关的毒力因子主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白(muraminidase releasedprotein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)等，但该菌致病机制不明，新的毒力因子有待发掘。本实验对普遍存在于革兰阳性菌中的重要膜转运蛋白sortase进行了初步功能研究，证实sortase编码基因srtA及其类似蛋白在SS2中的存在;同时构建了srtA基因的缺失株，通过动物实验证实缺失株毒力与野毒株相比有所下降;成功克隆并原核表达了05ZYH33的sortase蛋白，重组蛋白具有一定的免疫原性。1猪链球菌2型强毒株srt基因同源序列分析及srtA的表达借助生物信息学软件对SS2人源强毒力株05ZYH33基因组序列进行同源性检索，确定05ZYH33基因组编码sortase及其相关家族蛋白的数量和分布情况，得到6个与sortase编码基因同源的序列，其中SrtA及sortase-like归属sortase家族中的A组，SrtBCD和SrtE属B组，1个sortase-like基因为国内外首次发现。将srtA基因克隆于原核细胞***，DH5α中高效表达，重组表达产物可与SS2的兔多抗血清发生特异性反应。此外，制备sortase鼠多抗血清，间接ELISA检测的鼠多抗血清效价达1：6400。2猪链球菌srtA基因敲除突变株的构建及其特性研究构建中间为壮观霉素抗性基因，两侧为srtA编码基因上、下游同源序列的基因敲除载体，通过同源重组构建srtA基因缺失的突变株：PCR和Southern杂交鉴定突变株，筛选到1株srtA编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代的突变株05ZYH33△srtA，体外观察突变株05ZYH33△srtA的基本生物学性状，发现其革兰氏染色及溶血性与野毒株相比没有明显变化，动物实验证实srtA缺失株的毒力与野毒株相比有所下降。为进一步探讨猪链球菌2型分子致病机理奠定了研究基础．3猪链球菌2型sortase蛋白单克隆抗体的制备以表达、纯化去除跨膜区的Sornase蛋白为免疫原，常规免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，用纯化的sortase蛋白包被的间接ELIS人方法反复筛选和多次克隆化培养，筛选出1株特异分泌鼠抗Sonase蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D2;Wlestern blot分析显示，该单抗与全菌蛋白可产生两条特异性反应带。

关键词：猪链球菌2型 srtA基因 sortase 基因敲除