检索结果-南通市图书馆

作者：曹金秀南华大学

学位级别：硕士

铀作为核工业发展的主要原材料,在利用过程中会带来放射性核素污染问题,由此带来的危害主要表现在两个方面:化学毒性和辐射毒性。化学毒性表现在对肾脏、免疫系统、神经系统、生殖生育等影响,辐射毒性则是DNA致突和致癌作用。铀的现行... 详细信息

铀作为核工业发展的主要原材料,在利用过程中会带来放射性核素污染问题,由此带来的危害主要表现在两个方面:化学毒性和辐射毒性。化学毒性表现在对肾脏、免疫系统、神经系统、生殖生育等影响,辐射毒性则是DNA致突和致癌作用。铀的现行检测方法中,存在检测仪器昂贵,或是检测限高、干扰较大等问题。所以,建立简便、选择性好、灵敏度高的检测方法对于环境中铀污染物的有效监测、防患于未然是极其重要的。本文第二章建立了核酸外切酶III辅助底物碎片循环信号放大超灵敏检测铀酰离子的新方法。铀酰离子能特异性地与DNA酶作用,诱导DNA酶的构象发生变化,释放出ss DNA。加入MB之后,游离出的ss DNA与分子信标杂交形成双链,加入ExoⅢ后,外切酶Ⅲ对特定识别位点进行剪切,打开的MB被剪切为单个碱基,而ss DNA不被剪切并与下一个MB杂交,引起二次循环裂解,导致荧光信号积聚,经过多次循环,可使荧光信号放大。在优化出的最佳实验条件下,铀酰离子浓度范围为8.1×10-12mol/L.5×10-11mol/L时,体系的荧光变化值呈现较好的线性关系,线性回归方程为ΔF=162.3c（10-11mol/L）+22.01,相关系数r=0.990。根据空白管的标准偏差Sb和标准曲线的斜率k算出LOD为2.4p M。该方法选择性好,灵敏度高于迄今为止已报道的方法。本文第三章建立了非标记DNAzyme构象改变荧光法检测铀酰离子的新方法。实验表明,在p H 5.5 MES缓冲溶液中,当体系中不存在铀酰离子时,sybr greenⅰ（SG）能通过嵌入和小沟结合方式与脱氧核酶作用,导致荧光增强;当铀酰离子存在时,DNAzyme的r A碱基处断裂,游离出单链,此时SG与单链DNA作用减弱,荧光信号降低,且体系的荧光强度变化值与铀酰离子浓度在1.73×10–9～4.40×10–8 mol/L范围内呈良好线性关系,线性回归方程为ΔF=108.99c（×10-8mol/L）+79.22,相关系数r=0.990。根据空白管的标准偏差Sb和标准曲线的斜率k算出LOD为5.2×10–10 mol/L。该方法操作简单、选择性好,灵敏度高。本文第四章基于DNAzyme-MB-GO系统,提出了检测铀酰离子的生物传感策略。研究表明,铀酰离子能特异性地与DNAzyme作用,诱导DNA酶的构象发生变化,释放出单链DNA（ss DNA）,加入单标记的分子信标（MB）,游离出的ss DNA与MB杂交形成双链,随后加入氧化石墨烯（GO）,此时未被杂交的分子信标将会被氧化石墨烯吸附,导致荧光背景信号降低。铀酰离子浓度范围为1.35×10–9～2.5×10–8 mol/L和1.03×10–8～1.75×10–7 mol/L时,体系的荧光变化值呈现较好的线性关系,线性回归方程分别为ΔF=20.19c（×10-8 mol/L）+0.13和ΔF=26.59c（×10-7mol/L）+57.36;相关系数分别为r=0.980和r=0.993。根据空白管的标准偏差Sb和标准曲线的斜率k算出LOD为4.06×10–10mol/L。

关键词：铀 DNA酶分子信标外切酶Ⅲ 信号放大 sybr greenⅰ 氧化石墨烯

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基于DNA的线性荧光探针的初步研究

基于DNA的线性荧光探针的初步研究

作者：刘章华南昌大学

学位级别：硕士

多种或多个生物分子形成复合物来执行特定功能是细胞中非常常见的现象,如游离的核糖体和剪接体等,以及细胞膜上的离子通道和受体复合物等。了解这些复合物中各种或各个分子之间的相互位置关系和动态变化对于研究它们的结构和功能至关重... 详细信息

多种或多个生物分子形成复合物来执行特定功能是细胞中非常常见的现象,如游离的核糖体和剪接体等,以及细胞膜上的离子通道和受体复合物等。了解这些复合物中各种或各个分子之间的相互位置关系和动态变化对于研究它们的结构和功能至关重要。然而,这些复合物通常为纳米级尺寸(通常小于100 nm)。目前虽有X晶体衍射、冰冻电镜和荧光能量共振转移等技术可以实现纳米尺度的检测,但都有各自的缺点。激光共聚焦显微镜目前已成为常规技术,却因分辨率不够(通常>250 nm)而无法实现这种检测。我们课题组的策略是,将不同长度的线性荧光探针特异性标记复合物中的不同分子,通过线性形貌来放大复合物中不同分子之间的位置关系,使得较低分辨率的荧光共聚焦显微镜也能用于探测复合物中不同分子间的位置关系。作为前期探索性研究,本课题的主要目是制备这种线性荧光探针,并做初步的应用测试。我们采用不同长度的双链DNA分子来作为线性荧光探针。其优点是,DNA分子易于大量合成;可精确控制其长度(可获得任意长度的DNA);双链DNA分子的直径只有2 nm;有多种成熟方法让双链DNA分子带上荧光;DNA分子还具有丰富的基团可与其他小分子物质通过共价结合的方式结合,从而实现对目标分子的特异性标记;等等。因此,DNA分子非常适合作为线性荧光探针的材料。本课题利用修饰了生物素基团的引物、使用PCR仪成功合成了足够量的三种长度(分别约为50 nm,500 nm和1200 nm)的线性探针,并且使用两种方法(核酸染料sybr greenⅰ和ROX)使得其成为线性荧光探针。通过凝胶电泳检测证明三种探针均成功合成;通过质谱检测,探针上游引物的5’末端确实成功连接上生物素基团,且凝胶电泳结果显示这些探针能与链霉亲和素分子特异结合;通过流式细胞仪检测,DNA荧光探针的荧光强度随着DNA链长的增加而增加,且荧光强度远超过常用染料FITC。随后,我们使用荧光共聚焦显微镜检测了DNA线性荧光探针在包被有链霉亲和素分子的磁珠表面(模拟细胞表面)的荧光效果。结果显示,特异性结合效果明显,且随DNA线性荧光探针链长的增长荧光强度也增加。进一步我们用荧光共聚焦显微镜检测了DNA线性荧光探针在无核细胞(红细胞)和有核细胞表面的荧光效果。结果也显示,线性荧光探针与如今使用广泛的强荧光试剂相比效果相类似或更强。本课题中我们利用DNA分子的特性设计了一种新型的线性荧光探针,旨在利用探针的不同长度来分辨复杂分子结构的不同组成部分,不仅仅是单纯的利用不同荧光来分辨,希望利用此技术突破现有荧光技术分辨率的局限性。本课题为前期探索性研究,成功合成这种线性荧光探针,并初步检测了其荧光效果。后续研究将选择合适的分子复合物模型,用这种线性荧光探针特异性标记该复合物上的两个或多个分子,用激光共聚焦显微镜等技术对这些不同长度线性荧光探针的线性进行直接成像验证。

关键词：荧光探针脱氧核糖核酸线性 sybr greenⅰ

T4 DNA连接酶和氧化石墨烯在荧光生物传感器中的应用研究

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T4 DNA连接酶和氧化石墨烯在荧光生物传感器中的应用研究

作者：苏小妹广西师范大学

学位级别：硕士

生物酶和纳米材料在生物科技领域具有重要地位。利用生物酶和纳米材料而开发的生物传感器已经在临床诊断、药物筛选、环境监测和生化分析等研究领域得到了成功应用。在之前科研工作者的研究基础上继续开发新的生物传感器,是当今生化分... 详细信息

生物酶和纳米材料在生物科技领域具有重要地位。利用生物酶和纳米材料而开发的生物传感器已经在临床诊断、药物筛选、环境监测和生化分析等研究领域得到了成功应用。在之前科研工作者的研究基础上继续开发新的生物传感器,是当今生化分析的重要研究项目之一。荧光偏振分析方法具有通用性,稳定性好,且简单灵敏,非常适于均相分析。虽然荧光偏振方法已经在生化分析领域体现了它的优势,但把生物酶和纳米材料集成于荧光偏振分析中,设计更灵敏高效的生化分析方法以进一步扩展荧光偏振方法在生化分析中的应用,这仍是一项挑战,需要更多科研工作者的努力。本文旨在进一步拓展生物酶和纳米材料在荧光生化分析检测中的应用,在前人的研究基础上,设计了几种基于T4 DNA连接酶和氧化石墨烯的新型荧光生物传感器,分别用于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和寡核苷酸的检测,具体内容如下:1.基于T4 DNA连接酶的ATP依赖连接活性和外切酶Ⅲ对双链DNA(dsDNA)从3’平末端或凹末端到5’末端的特异性切割,以氧化石墨烯作为信号增强因子,建立了一个荧光偏振分析平台用于灵敏检测ATP。首先,5’磷酸化的DNA探针(P-DNA)和荧光素衍生物(FAM)标记的DNA(F-DNA)同时与一个长的互补DNA(C-DNA)杂交,形成中间具有一个切口的双链DNA。若无ATP,p-DNA和F-DNA的末端无法连接,外切酶Ⅲ降解双链DNA中的含有3’凹末端的F-DNA和3’平末端的C-DNA,FAM标记的DNA碎片从GO表面解吸,由于DNA碎片分子量很小,转动速度较快,荧光偏振值较小。在ATP存在下,T4 DNA连接酶催化P-DNA和F-DNA的临近末端连接,得到3’末端突出6个碱基的新的DNA长链。此时外切酶Ⅲ只能降解双链DNA中的C-DNA,剩下新的连接而成的单链DNA长链被吸附在氧化石墨烯表面。荧光团因为氧化石墨烯的吸附而分子量明显增加,转动速度减慢,荧光偏振值增大。荧光偏振变化值随ATP浓度的增大而增大,荧光偏振变化值与ATP在0.1?70nmol/L的浓度范围内呈良好线性关系,检测限为0.20nmol/L。2.本实验基于ATP依赖性的连接反应与支点链取代反应,建立了一种氧化石墨烯辅助信号增强的荧光偏振检测ATP的新方法。实验用到四种DNA链:5’-末端磷酸化的DNA单链(P-DNA)、辅助DNA单链(A-DNA)、互补DNA模板(C-DNA)和FAM标记的链取代DNA单链(F-DNA)。首先P-DNA与A-DNA同时与C-DNA杂交,得到一个含有一个切口和一端突出7个碱基(支点)的dsDNA。ATP不存在时,T4 DNA连接酶无法连接dsDNA切口,此时加入F-DNA,F-DNA通过支点链取代反应把P-DNA从dsDNA中置换出来。F-DNA由于与C-DNA杂交成dsDNA而不被氧化石墨烯吸附,此时由于双链DNA分子量较小,转动速度快,荧光偏振值较小。当存在ATP时,T4 DNA连接酶连接P-DNA与A-DNA成新的DNA长链,,F-DNA无法将该DNA长链置换出来,F-DNA被氧化石墨烯吸附,荧光团体积明显增大,转动速度减慢,荧光偏振值增大。荧光偏振变化值与ATP浓度在0.8?80nmol/L的范围内呈良好线性关系,检测限为0.78nmol/L。该方法为特异性、简单且低成本地检测ATP提供了新选择。3.本工作借助外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ降低背景信号,以插入荧光染料sybr greenⅰ(SGⅠ)为荧光信号,开发了一种T4 DNA连接酶辅助的无标记荧光分析方法用于定量检测乙肝病毒DNA(HBV DNA)。在该工作中,设计了一个哑铃状DNA探针,由含有一个切口的茎部区域和两个环部区域组成。若无HBV DNA,T4 DNA连接酶会连接哑铃DNA临近的5’末端和3’末端,哑铃DNA处于封闭环状,外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ无法将其水解。SGⅠ与哑铃DNA的茎部区域结合,荧光强度显著增强。当加入HBV DNA,靶标DNA与哑铃DNA杂交而把哑铃DNA打开,此时T4 DNA连接酶无法连接哑铃DNA的5’末端和3’末端。外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ降解靶标DNA和哑铃DNA,SGⅠ游离于溶液中,荧光强度很弱。荧光强度降低效率与靶标DNA的浓度呈线性关系,线性范围为1?35nmol/L,检测限为4.26nmol/L。该方法可以拓展用于其他DNA或RNA的检测。

关键词： T4DNA连接酶氧化石墨烯 ATP 外切酶 sybr greenⅰ

泡球蚴感染小鼠肝脏IL-17实时荧光定量RT-PCR方法的建立与检测

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泡球蚴感染小鼠肝脏IL-17实时荧光定量RT-PCR方法的建立与检测

作者：张志新疆医科大学

学位级别：硕士

目的：建立检测泡球蚴感染小鼠肝脏IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。观察泡球蚴（Em）感染Balb/c小鼠肝脏中IL-17的表达,探讨其在泡型包虫感染免疫发生中的作用与机制。方法：通过腹腔注射100μ1泡球... 详细信息

目的：建立检测泡球蚴感染小鼠肝脏IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。观察泡球蚴（Em）感染Balb/c小鼠肝脏中IL-17的表达,探讨其在泡型包虫感染免疫发生中的作用与机制。方法：通过腹腔注射100μ1泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,感染4wk后处死,提取肝脏总RNA,反转录得到cDNA;登陆GenBank,得到IL-17基因（U43088.1）全序列,选取保守序列,应用primer 5设计引物,β-actin作为内参,以10倍梯度稀释IL-17 PCR产物为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR以确定方法的特异性和灵敏度;绘制标准曲线,确定IL-17基因检测的最佳条件。HE和Masson染色观察肝组织病理改变和纤维化程度;免疫组织化学技术检测IL-17在肝内的表达及定位。结果：1)用建立的实时定量RT-PCR检测IL-17基因无非特异性扩增,各样品熔解温度均在81.0℃,熔解峰单一;mRNA检出限为1×102pg,106～102pg总RNA均有扩增;泡球蚴感染4周后,IL-17基因表达显著增加,感染组和对照组分别为（0.008728±0.000984）和（0.003823±0.00082）,差异有统计学意义（t=-3.598,P＜0.05）2)病理学观察感染时肝汇管周围有炎细胞浸润和肝纤维化加重。3)免疫组织化学显示IL-17主要表达部位是肝窦区、胞浆、胞膜及病灶处的生发层周围。感染组和对照组分别为（2.64±0.66）和（1.45±0.57）差异有统计学意义（t=＝-2.845,P＜0.05）。结论：成功建立了小鼠源IL-17基因实时定量RT-PCR检测体系。经检测,小鼠感染泡球蚴4wk后IL-17基因和蛋白表达增加,表明IL-17在泡球蚴感染免疫调节中可能起重要作用。

关键词：泡球蚴肝脏实时荧光定量RT-PCR IL-17 sybr greenⅰ 免疫组织化学技术

三阴性乳腺癌IL-17基因Real-time qPCR检测法的建立与应用

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三阴性乳腺癌IL-17基因Real-time qPCR检测法的建立与应用

作者：孟庆杰中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤发病率之首,死亡率位居女性恶性肿瘤致死率第二。根据肿瘤的基因表达特征,将乳腺癌分为4个亚型,分别为Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型、基底细胞样型/三阴... 详细信息

研究背景:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤发病率之首,死亡率位居女性恶性肿瘤致死率第二。根据肿瘤的基因表达特征,将乳腺癌分为4个亚型,分别为Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型、基底细胞样型/三阴性亚型。各亚型细胞的表面受体表达不同,其治疗方法和患者预后明显不同。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指乳腺癌细胞均不表达雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progestrone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(HER2,Human Epidermal Growth Factor receptor 2)。TNBC因其患者预后差,复发转移率高受到广泛关注。白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)主要由Th17细胞产生分泌,是哺乳动物的免疫系统中的核心成员,有促进炎症发生发展的特性,可以作用于一系列炎症细胞,促进细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶等的表达。近年来发现IL-17在肿瘤免疫和治疗预防中发挥着重要作用。在多种组织中IL-17蛋白的表达水平较低甚至不表达,却可见IL-17的mRNA的表达,因此本研究的目的在于建立一种可以有效检测IL-17 mRNA表达量的方法,并在TNBC中检测IL-17的表达量,研究IL-17与TNBC的关系,为探索TNBC的发病机制和TNBC的诊疗提供新的思路和方向。目的:1.探究TNBC与正常乳腺组织中IL-17表达是否存在差异。2.分析IL-17的表达与TNBC患者预后是否具有相关性。方法:1.新鲜乳腺组织标本的获取2016年1月到2017年3月从西京医院甲乳血管外科获取新鲜人乳腺组织标本,冻存并保存于-80℃冰箱中,从中分离一部分组织,用福尔马林进行固定,用于送病理检测,以确定乳腺癌病理学类型。2.病理检测将已经固定好的标本组织进行石蜡包埋、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,在光镜下观察各组织标本的病理学变化,以便确定标本为乳腺癌或是正常乳腺组织。随后采用免疫组织化学染色法,进一步确定乳腺癌组织为TNBC用以本研究。3.引物设计合成选择β-actin作内参,参考人源IL-17和β-actin在Genebank中的基因序列,用Primer 5软件进行分析并选取同源性高的区域用以设计本研究的引物,将设计好的引物序列交由TakaRa(中国)生物公司合成。4.总RNA的提取和反转录采用Trizol法提取组织标本的总RNA,用NanoDrop核酸蛋白测定仪对提取到的总RNA浓度进行测定。随后进行反转录合成cDNA,将产物保存于于-20℃冰箱中备用。5.IL-17及β-actin退火温度的确定根据Takara合成的IL-17和β-actin引物的Tm值,分别设置温度梯度43℃8℃和50℃0℃进行PCR,选择最佳退火温度。6.实时荧光定量PCR反应以反转录得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应,随后用琼脂糖凝胶电泳法对扩增得到的产物进行鉴定。7.乳腺组织中IL-17 mRNA表达量的测定利用所建立的实时荧光定量PCR法检测两组标本组织中IL-17和β-actin mRNA的初始模板量,以IL-17/β-actin作为两组标本中IL-17 mRNA的相对表达量,予以统计分析。8.免疫组化检测TNBC组标本Ki-67及E-cadherin的表达情况运用Image-ProPlus(IPP)高级图象分析软件进行图像信息分析,定量测定TNBC组织标本切片免疫组化的IOD值。9.IL-17 mRNA与Ki-67、E-cadherin的相关性分析将TNBC组织标本中IL-17mRNA表达和Ki-67、E-cadherin免疫组化定量指标IOD做相关性分析。10.分析TNBC患者组织中IL-17mRNA与临床病理特征之间的关系TNBC患者肿瘤组织中,IL-17的表达可能存在差异,为了进一步明确,对不同临床病理指标进行分层分析。结果:1.组织标本一般情况实验组及对照组标本经过术后免疫组化明确后,发现实验组中符合纳入条件的三阴性乳腺癌的标本16例,对照组符合纳入条件的为18例。2.IL-17和β-actin退火温度的确定分析PCR熔解曲线,按照Ct值越小-峰越高则灵敏度越高的原则,选择IL-17的最佳退火温度为49.3℃,β-actin的最佳退火温度为53.9℃。3.IL-17和β-actin RT-qPCR特异性对两个基因片段的PCR扩增熔解曲线和2%琼脂糖凝胶电泳结果进行分析,认为PCR过程中未发生非特异性扩增反应,且无引物二聚体产生,引物具有较高的特异性。4.IL-17和β-actin RT-qPCR敏感性对实时荧光定量PCR反应的结果进行分析后发现PCR的扩增效率相近;Ct值与起始拷贝数之间存在严格的线性关系。5.IL-17

关键词：三阴性乳腺癌白细胞介素-17 实时荧光定量PCR sybr greenⅰ Ki-67 E-钙粘蛋白

猪德尔塔冠状病毒流行病学调查、荧光定量PCR检测方法建立及应用

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猪德尔塔冠状病毒流行病学调查、荧光定量PCR检测方法建立及应用

作者：张世亨吉林农业大学

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猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的肠道冠状病毒,临床表现为水样腹泻和呕吐,迅速脱水,衰竭而亡。各阶段猪均可感染,新生哺乳仔猪最易感染,发病率可达50%00%,死亡率高达100%,给养猪业造成巨大的经济损... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的肠道冠状病毒,临床表现为水样腹泻和呕吐,迅速脱水,衰竭而亡。各阶段猪均可感染,新生哺乳仔猪最易感染,发病率可达50%00%,死亡率高达100%,给养猪业造成巨大的经济损失。目前还没有可以针对PDCoV感染的专门治疗和预防的措施。为揭示PDCoV的遗传变异及流行规律,本研究通过对山东省、广西壮族自治区部分地区猪腹泻样品进行PDCoV检测,并获得一株PDCoV全长。同时本研究建立快速高效PDCoV的荧光定量方法诊断,对PDCoV的防控工作提供更为全面的理论依据,本研究进行了以下工作:1.根据GenBank公布的PDCoV、TGEV、PEDV和PoRV基因序列,设计检测引物,对2017年9月-2019年1月,采集山东省、广西壮族自治区部分大型猪场仔猪腹泻样品140份进行检测。结果表明,140份病料中有13份为PDCoV核酸阳性,阳性率为9.29%;PEDV、TGEV、PoRV阳性率分别为20%、29%、13.75%,其中PEDV和PDCoV、PoRV和PDCoV混合阳性率分别为6.43%和3.57%。表明当前PDCoV易与其他病毒混合感染。参考PDCoV CHN-AH-2004株（GenBank登录号:KP757890.1）基因序列,分别设计25对特异性引物对PDCoV阳性进行RT-PCR分段扩增,拼接获得1株PDCoV全基因组全长。使用软件与参考毒株进行系统进化树和同源性分析。结果表明,PDCoV CHN-GX-2018株基因组全长25,407 bp,与美国分离株比较存在2处重大变化:（1）ORF1a/1b存在2处氨基酸缺失（第400-403aa、第756-759aa位置）;（2）S基因存在1个氨基酸的缺失。根据遗传系统进化树分析PDCoV CHN-GX-2018与东南亚地区参考毒株处于同一分支,亲缘性较近。2.建立一种快速检测PDCoV荧光定量PCR方法,根据PDCoV N基因序列设计特异性引物,建立了实时荧光定量PCR方法。结果表明:通过线性回归分析,标准曲线斜率为-4.90,相关系数为0.999,表明Ct与模板浓度之间具有良好的线性关系。所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;方法检测下限为6.31×10～1 copies/μL;特异性显示PEDV和TGEV等均没有扩增;利用该方法对60份临床猪粪便样品进行检测,结果显示PDCoV阳性率5.0%,表明本研究建立的方法可以快速且灵敏地检测PDCoV,为PDCoV的预防和疫苗的研究奠定基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒流行病学调查基因组序列 sybr greenⅰ

重要食品掺假检测技术研究鱼糜制品中主料含量的测定（荧光PCR法）

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重要食品掺假检测技术研究鱼糜制品中主料含量的测定（荧光PCR法）

作者：曲勤凤复旦大学

学位级别：硕士

市场上鱼糜制品的生产企业较多,产品的价格也因其主料（鱼肉）的成分和含量高低而不同,然而有些不法商贩添加很少的主料或不添加主料,却冠以鱼糜制品（如鱼丸）的名称进行销售以牟取较高的利润。监管部门必须具备有效的技术平台去规范... 详细信息

市场上鱼糜制品的生产企业较多,产品的价格也因其主料（鱼肉）的成分和含量高低而不同,然而有些不法商贩添加很少的主料或不添加主料,却冠以鱼糜制品（如鱼丸）的名称进行销售以牟取较高的利润。监管部门必须具备有效的技术平台去规范销售市场,保护消费者的利益。但是目前国内外均无对鱼糜制品中主料含量测定的相关检测技术,本研究所建立的检测方法能填补鱼糜制品中主料含量测定的检测技术空白,并为其他相关产品主料含量的测定提供一定的参考依据。目前应用于食品检测的实时荧光定量PCR技术主要有以下两种方法：1、sybr greenⅰ染料法和Taqman探针法。本研究通过大量的实验比较了两种不同的实时荧光定量PCR的检测方法,最终选择适合本研究且成本较低的sybr greenⅰ荧光染料定量PCR法对鱼糜制品中主料成分进行定量分析。该方法主要是寻找鱼类特异性引物作为外源基因以及同时能扩增动物源性和植物源性成分的通用引物作为内参校正基因对鱼糜制品标准品建立标准曲线,利用标准曲线计算出鱼糜制品中主料成分的质量百分数。本研究建立的方法线性程度良好（R2＞0.985）、回收率为88.0%-107.0%、检出限为0.05%,所建立的线性模型均符合检测方法学要求,并在实验室模拟环境下获得了较为可靠的数据结果,从而证明了本方法在实验室条件下的可行性。考虑到市场上不同鱼糜制品制作工艺的不同,本研究在检测方法的具体适用性和最终的实际应用方面仍有待继续探索。

关键词：实时荧光定量PCR sybr greenⅰ Taqman 鱼糜制品质量百分数

CYP1A1 NAT2 GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性关系的病例对照研究

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CYP1A1 NAT2 GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性关系的病例对照研究

作者：郑德杰天津医科大学

学位级别：硕士

目的：肺癌是影响人类生存和健康的严重疾病,在世界范围肺癌的发生率和死亡率都位居首位。医学科技的飞速发展极大地改变了医学的面貌,但肺癌的诊断和治疗依然不尽如人意,肺癌的发病率和死亡率较50年前增加了数十倍,且肺癌总的治愈率水... 详细信息

目的：肺癌是影响人类生存和健康的严重疾病,在世界范围肺癌的发生率和死亡率都位居首位。医学科技的飞速发展极大地改变了医学的面貌,但肺癌的诊断和治疗依然不尽如人意,肺癌的发病率和死亡率较50年前增加了数十倍,且肺癌总的治愈率水平仍然低于15%,因此将肺癌的防控重点由治疗转为预防,开展肺癌的早期诊断研究就显得尤为重要。研究显示肺癌的发生是吸烟、环境因素及个体遗传易感性综合因素的影响。人类基因组计划及后来的人类基因组单体型计划（HapMap）计划的完成为从基因水平上研究易感基因SNP及单体型与肺癌遗传易感性提供了极大的便利。CYP1A1、NAT2、GSTM1是参与体内致癌物质活化和解毒的重要的Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶基因,其基因多态性被认为与肺癌的遗传易感性有关。本实验选择了CYP1A1、NAT2基因中能够引起编码蛋白改变的五个SNP位点（rs1048943,rs4646422,rs1799930,rs1208,rs1799931）,采用敏感性、特异性高,易实现高通量的方法探讨汉族人群CYP1A1、NAT2基因的5个SNP及GSTM1基因在中国汉族人群中的多态性,并用统计方法构建出CYP1A1、NAT2基因单体型,研究它们与肺癌遗传易感性之间的关系。方法：我们采用病例对照研究,共纳入2008年5月至2009年7月天津医科大学总医院胸部肿瘤中心肺癌住院病例266例,同期与天津医科大学总医院健康体检中心常规体检者307例。应用Taqman探针技术检测CYP1A1及NAT2基因多态性,应用sybr green I实时荧光PCR结合熔解曲线分析方法检测GSTM1基因型。应用PHASEv2.0软件构建CYP1A1和NAT2基因单体型,应用非条件Logistic回归分析方法研究上述基因基因型及单体型与肺癌遗传易感性之间的关系,以OR值和95%CI表示肺癌风险性,并分层分析吸烟与上述基因多态性及单体型与肺癌遗传易感性的关系,以及上述基因多态性和单体型与不同肺癌病理类型之间的关系。结果：1.本研究对CYP1A1基因rs1048943和rs4646422多态性单独及其二者构成的单体型与肺癌遗传易感性之间的关系进行了探讨,发现CYP1A1rs1048943多态总体及按吸烟与病理分层均与肺癌遗传易感性无关。CYP1A1rs4646422多态性TT基因型与肺癌风险临界相关。由以上两个SNP位点构成的单体型,在60及60岁以上人群中,单体型CG增加患肺癌风险。2.本实验中采用Taqman方法分析NAT2基因的rs1799930,rs1208,rs1799931多态性,并构建NAT2的单体型及双倍型,并研究了NAT2 SNP、单体型、双倍型与肺癌遗传易感性之间的关系,结果表明NAT2 rs1799930,rs1799931多态性与肺癌遗传易感性无关;在双倍型中NAT2中间代谢型,慢代谢型均与肺癌遗传易感性无关。NAT2rs1208多态性及在非吸烟者降低肺癌风险。单体型NAT2*12A降低肺癌风险。3.本实验采用sybr greenⅰ染料法探讨GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间的关系,结果显示GSTM1（-）在肺癌组和对照组的频率为（56.6%和57.0%）。GSTM1（-）基因型在肺癌组合对照组之间的分布无统计学差别。以GSTM1（+）为参照,GSTM1（-）基因型携带者患肺癌风险未见增加。分层分析显示,GSTM1（-）基因型与各型肺癌：鳞癌、腺癌、小细胞肺癌及其他肺癌的风险性无关。在非吸烟组中,对照组携带GSTM1（-）基因型者高于肺癌组,GSTM1（-）基因型携带者患肺癌风险性降低,且差别具有统计学意义;在吸烟组中,吸烟组中GSTM1（-）基因型携带者升高患肺癌风险性,但无统计学差别。结论：CYP1A1 rs4646422多态性TT基因型与肺癌风险临界相关;CYP1A1基因rs4646422 rs1048943构成的单体型CG在60及60岁以上人群中,单体型CG增加患肺癌风险。NAT2 rs1208基因多态性及在非吸烟者降低肺癌风险。单体型NAT2*12A与肺癌低风险性有关。

关键词： CYP1A1 NAT2 GSTM1 基因多态单体型肺肿瘤 Taqman sybr greenⅰ

基于Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针的金黄色葡萄球菌检测研究

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基于Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针的金黄色葡萄球菌检测研究

作者：李玉红湖南大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,是人类化脓感染中最常见的病原菌。美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。近年来,很多快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌的方法在生物医学分析领域中发挥了重要作用... 详细信息

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,是人类化脓感染中最常见的病原菌。美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。近年来,很多快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌的方法在生物医学分析领域中发挥了重要作用,尤其是一些利用抗体-抗原识别原理发展的生物传感方法,如原子力显微镜法、酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法及荧光免疫测定法等。然而基于抗体-抗原识别原理发展的金黄色葡萄球菌生物传感方法由于抗体的难合成、不易修饰、生物活性不稳定且成本高等而导致其存在一定的局限性。核酸适配体(Aptamer)作为一种新型特异性识别分子具有高稳定性、高选择性,且稳定性好、合成简便、容易标记、适用性广等优点,为发展快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法提供了新的思路。然而目前报道的基于Aptamer特异性识别的金黄色葡萄球菌检测方法主要是电化学传感法和荧光光谱测定法,这些方法操作复杂,且不能实现高通量检测。双色流式细胞术能对细胞或者其他生物粒子进行定性、定量分析。与传统的检测方法相比,具有免洗和速度快等优点,成为当代先进的细胞、生物粒子定量分析技术之一。同时,融合介电电泳原理和微流控芯片技术发展介电泳驱动在线富集技术能对细胞、细菌等复杂生化样品进行高效迅速富集和分离,为建立快速、灵敏的细菌体系检测提供了技术平台。本论文即以实现金黄色葡萄球菌的快速、灵敏检测为研究目标,采用Aptamer作为特异性识别分子,结合本课题组已发展的基于荧光纳米颗粒标记信号放大技术的双色流式细胞术和基于荧光纳米颗粒标记信号放大技术的微流控芯片介电电泳富集技术,开展了基于Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针的金黄色葡萄球菌检测研究,主要工作如下：一、基于Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针的双色流式细胞术用于金黄色葡萄球菌检测研究以Aptamer作为特异性分子识别探针,结合课题组的荧光纳米颗粒标记双色流式细胞术发展了一种快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法。在该方法中,首先采用点击化学反应将特异性识别金黄色葡萄球菌的Aptamer修饰在二氧化硅荧光纳米颗粒表面,获得Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针复合物,然后考察该复合物探针对金黄色葡萄球菌的特异性识别,并通过激光共聚焦显微镜成像实验证实识别效果。在此基础上,将Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针与金黄色葡萄球菌样品进行孵育,然后以核酸染料sybr green I对荧光标记的金黄色葡萄球菌进行核酸染色,通过双参数流式细胞术对样品中双色标记的金黄色葡萄球菌进行分析检测。结果表明,该Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针具有非常高的选择性和灵敏度,以核酸染料对细菌进行染色,显著地减小了由纳米颗粒团聚所引起的假阳性信号,对缓冲液体系和牛奶样品中掺杂金黄色葡萄球菌的检测下限分别为1.5×102和7.6×102cells mL-1。与基于抗体-抗原免疫反应的传统流式细胞术相比,该方法具有更高的检测灵敏度。二、基于Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针的微流控芯片介电电泳富集技术用于金黄色葡萄球菌检测研究以Aptamer作为特异性分子识别探针,结合课题组的荧光纳米颗粒标记信号放大的微流控芯片介电电泳富集技术发展了一种金黄色葡萄球菌的实时、连续、快速和高灵敏检测新方法。在该方法中,先将Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针复合物与金黄色葡萄球菌进行孵育,通过Aptamer对目标金黄色葡萄球菌的特异性识别,从而将Aptamer/二氧化硅荧光纳米探针复合物标记到金黄色葡萄球菌上进行荧光信号放大,然后将该样品通入到微流控芯片中,并采用介电电泳驱动技术对金黄色葡萄球菌进行实时、定向富集;最后通过监测富集区域的荧光强度,实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。结果表明,该方法可以实现去离子水和实际水样中金黄色葡萄球菌的实时、在线富集检测,其检测限为93cells mL-1。与传统的金黄色葡萄球菌检测方法相比,该方法能实现对目标细菌进行在线富集检测,且具有更高的检测灵敏度。

关键词：金黄色葡萄球菌 Aptamer探针二氧化硅荧光纳米颗粒 sybr greenⅰ 双色流式细胞术微流控芯片介电电泳富集技术

热休克预处理对人晶状体上皮细胞HSP60mRNA表达的影响及意义

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热休克预处理对人晶状体上皮细胞HSP60mRNA表达的影响及意义

作者：饶丽娜南昌大学

学位级别：硕士

目的采用sybr green I实时荧光定量PCR方法检测人晶状体上皮细胞在不同环境刺激处理后HSP60mRNA的表达的变化,探讨HSP60mRNA表达变化规律以及不同环境刺激处理后表达是否有差异。方法采用正常人组织源性晶状体上皮细胞HUM-C... 详细信息

目的采用sybr green I实时荧光定量PCR方法检测人晶状体上皮细胞在不同环境刺激处理后HSP60mRNA的表达的变化,探讨HSP60mRNA表达变化规律以及不同环境刺激处理后表达是否有差异。方法采用正常人组织源性晶状体上皮细胞HUM-CELL-0098进行细胞传代培养后,将传代培养后的细胞进行分组实验,在氧化条件以及热休克处理后加氧化条件下培养细胞30min后,在正常培养条件下继续培养并且选取不同时间点（Oh、2h、4h、6h、16h、24h）的细胞采用sybr green I实时荧光定量PCR检测HSP60mRNA的表达情况。结果观察到晶状体上皮细胞在不同环境刺激下均表达HSP60mRNA,但热休克预处理后的细胞HSP60mRNA的表达较未热休克处理细胞高。氧化应激条件下HSP60mRNA的表达明显增加,在刺激结束后表达含量为最高,以后逐渐下降;在热休克预处理组中HSP60mRNA的表达含量也明显增加,但在4h表达量最高,以后逐渐下降。两组细胞在不同时段HSP60mRNA表达量变化趋势不同F=178.786,P=0.007,P＜0.05,有统计学意义。此外,热休克预处理组与单纯氧化应激组中HSP60mRNA表达含量有显著差异,热休克处理组的表达含量较单纯氧化应激组高,存在组间差别F=193.118,P=0.001,P＜0.05,有统计学意义。时间与分表交互作用F=124.939,P=0.003,有统计学意义。两组细胞HSP60mRNA表达量进行各个时间两两对比发现这两组数据在统计学上有差异。此外,还发现热休克处理后的细胞表达HSP60mRNA可能具有时间依赖性。结论人晶状体上皮细胞在不同应激条件下,均能诱导HSP60mRNA的合成,但在不同应激条件下的HSP60mRNA的表达是具有差异的,热休克预处理后的细胞HSP60mRNA的表达高于氧化损伤处理的细胞,给予预先的热休克处理可通过提高HSP60mRNA表达来保护晶状体。

关键词：晶状体上皮细胞热休克蛋白60 热休克预处理 sybr greenⅰ 实时荧光定量PCR