T4 DNA连接酶和氧化石墨烯在荧光生物传感器中的应用研究

作     者：苏小妹 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田建袅

授予年度：2015年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0802[工学-机械工程] 0703[理学-化学] 

主      题：T4DNA连接酶 氧化石墨烯 ATP 外切酶 SYBR GreenⅠ 

摘      要：生物酶和纳米材料在生物科技领域具有重要地位。利用生物酶和纳米材料而开发的生物传感器已经在临床诊断、药物筛选、环境监测和生化分析等研究领域得到了成功应用。在之前科研工作者的研究基础上继续开发新的生物传感器,是当今生化分析的重要研究项目之一。荧光偏振分析方法具有通用性,稳定性好,且简单灵敏,非常适于均相分析。虽然荧光偏振方法已经在生化分析领域体现了它的优势,但把生物酶和纳米材料集成于荧光偏振分析中,设计更灵敏高效的生化分析方法以进一步扩展荧光偏振方法在生化分析中的应用,这仍是一项挑战,需要更多科研工作者的努力。本文旨在进一步拓展生物酶和纳米材料在荧光生化分析检测中的应用,在前人的研究基础上,设计了几种基于T4 DNA连接酶和氧化石墨烯的新型荧光生物传感器,分别用于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和寡核苷酸的检测,具体内容如下:1.基于T4 DNA连接酶的ATP依赖连接活性和外切酶Ⅲ对双链DNA(dsDNA)从3’平末端或凹末端到5’末端的特异性切割,以氧化石墨烯作为信号增强因子,建立了一个荧光偏振分析平台用于灵敏检测ATP。首先,5’磷酸化的DNA探针(P-DNA)和荧光素衍生物(FAM)标记的DNA(F-DNA)同时与一个长的互补DNA(C-DNA)杂交,形成中间具有一个切口的双链DNA。若无ATP,p-DNA和F-DNA的末端无法连接,外切酶Ⅲ降解双链DNA中的含有3’凹末端的F-DNA和3’平末端的C-DNA,FAM标记的DNA碎片从GO表面解吸,由于DNA碎片分子量很小,转动速度较快,荧光偏振值较小。在ATP存在下,T4 DNA连接酶催化P-DNA和F-DNA的临近末端连接,得到3’末端突出6个碱基的新的DNA长链。此时外切酶Ⅲ只能降解双链DNA中的C-DNA,剩下新的连接而成的单链DNA长链被吸附在氧化石墨烯表面。荧光团因为氧化石墨烯的吸附而分子量明显增加,转动速度减慢,荧光偏振值增大。荧光偏振变化值随ATP浓度的增大而增大,荧光偏振变化值与ATP在0.1?70nmol/L的浓度范围内呈良好线性关系,检测限为0.20nmol/L。2.本实验基于ATP依赖性的连接反应与支点链取代反应,建立了一种氧化石墨烯辅助信号增强的荧光偏振检测ATP的新方法。实验用到四种DNA链:5’-末端磷酸化的DNA单链(P-DNA)、辅助DNA单链(A-DNA)、互补DNA模板(C-DNA)和FAM标记的链取代DNA单链(F-DNA)。首先P-DNA与A-DNA同时与C-DNA杂交,得到一个含有一个切口和一端突出7个碱基(支点)的dsDNA。ATP不存在时,T4 DNA连接酶无法连接dsDNA切口,此时加入F-DNA,F-DNA通过支点链取代反应把P-DNA从dsDNA中置换出来。F-DNA由于与C-DNA杂交成dsDNA而不被氧化石墨烯吸附,此时由于双链DNA分子量较小,转动速度快,荧光偏振值较小。当存在ATP时,T4 DNA连接酶连接P-DNA与A-DNA成新的DNA长链,,F-DNA无法将该DNA长链置换出来,F-DNA被氧化石墨烯吸附,荧光团体积明显增大,转动速度减慢,荧光偏振值增大。荧光偏振变化值与ATP浓度在0.8?80nmol/L的范围内呈良好线性关系,检测限为0.78nmol/L。该方法为特异性、简单且低成本地检测ATP提供了新选择。3.本工作借助外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ降低背景信号,以插入荧光染料SYBR GreenⅠ(SGⅠ)为荧光信号,开发了一种T4 DNA连接酶辅助的无标记荧光分析方法用于定量检测乙肝病毒DNA(HBV DNA)。在该工作中,设计了一个哑铃状DNA探针,由含有一个切口的茎部区域和两个环部区域组成。若无HBV DNA,T4 DNA连接酶会连接哑铃DNA临近的5’末端和3’末端,哑铃DNA处于封闭环状,外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ无法将其水解。SGⅠ与哑铃DNA的茎部区域结合,荧光强度显著增强。当加入HBV DNA,靶标DNA与哑铃DNA杂交而把哑铃DNA打开,此时T4 DNA连接酶无法连接哑铃DNA的5’末端和3’末端。外切酶Ⅲ和外切酶Ⅰ降解靶标DNA和哑铃DNA,SGⅠ游离于溶液中,荧光强度很弱。荧光强度降低效率与靶标DNA的浓度呈线性关系,线性范围为1?35nmol/L,检测限为4.26nmol/L。该方法可以拓展用于其他DNA或RNA的检测。