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香辛料sybr green Ⅰ 染料荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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食品科学 2024年

作者：杨晴丽王仁静张茹孟宪卓姚帮本陈赵然张旭方建军陈伟合肥工业大学食品与生物工程学院衢州市食品药品检验研究院安徽省产品质量监督检验研究院

目的：本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法，为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法，在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析，为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法：研究采用sybr green I染料实时荧光定... 详细信息

目的：本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法，为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法，在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析，为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法：研究采用sybr green I染料实时荧光定量PCR方法，通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果显示，该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒，Ct值在标品含量0.001%～10%范围内线性关系良好。针对八角标准品，最低检测限LOD为1%；针对茴香、花椒、胡椒标准品，最低检测限LOD均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测，分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒；样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒；样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结果表明，本试验建立的sybr green Ⅰ 染料法荧光定量PCR方法灵敏度高、重复性好，可应用于实际样品的检测。

关键词：香辛料 sybr greenⅰ染料实时荧光定量PCR 检测

鹅源星状病毒TaqMan探针和sybr green Ⅰ染料法荧光定量PCR检测方法的建立及其应用比较

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中国兽医学报 2022年第10期42卷 1970-1976页

作者：邓昕竹余群朱盈名赵自亮陆婧赵光伟张立武程方俊杨晓伟西南大学动物医学学院重庆荣昌402460 重庆三杰众鑫生物工程有限公司重庆荣昌402460

鹅源星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)是国内新发雏鹅痛风病病原,为更好地应用于临床检测,本试验针对GoAstV分别建立了基于TaqMan探针和sybr greenⅰ染料的2种实时荧光定量PCR方法,并比较两者的优劣。首先根据GoAstV的ORF1b基因保守... 详细信息

鹅源星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)是国内新发雏鹅痛风病病原,为更好地应用于临床检测,本试验针对GoAstV分别建立了基于TaqMan探针和sybr greenⅰ染料的2种实时荧光定量PCR方法,并比较两者的优劣。首先根据GoAstV的ORF1b基因保守序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,分别建立TaqMan和sybr greenⅠ荧光定量PCR方法,并对其进行特异性、敏感性、重复性测定和临床样品检验。结果显示,2种方法均能特异性检测GoAstV,Ct值在质粒标准品浓度2.5×10~2~2.5×10~8 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数均为0.999;探针法和染料法的最低检测限分别为2.5×10~1,2.5×10~2 copies/μL;2种方法重复性试验组内与组间变异系数均小于2.50%。对近1年收集的71份临床疑似样本进行检测,探针法和染料法的阳性检出率分别为49.30%和42.25%,探针法的检出率较高。结果表明,本试验建立的TaqMan探针和sybr greenⅰ染料荧光定量PCR方法均具有特异性强、敏感性高、重复性好优点,可应用于临床GoAstV的检测,其中尤以TaqMan探针法的灵敏度较高。

关键词：鹅源星状病毒荧光定量PCR TaqMan探针 sybr greenⅰ染料

鸭星状病毒1型sybr green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及其在病毒分离鉴定中的应用

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中国兽医学报 2024年第6期 1127-1132+1139页

作者：陶禹冯旭东樊彦丽王艳赵自亮杨晓伟张立武陈翔赵光伟西南大学动物医学院上海海关重庆三杰众鑫生物工程有限公司

为实现鸭星状病毒1型（Duck astrovirus type 1,DAstV-1）的快速检测，本试验针对DAstV-1（WF1202株）保守区域设计特异性引物，建立了基于染料sybr greenⅠ的实时荧光定量PCR（qPCR）方法，利用所建方法对临床样本进行检测，并将其应... 详细信息

为实现鸭星状病毒1型（Duck astrovirus type 1,DAstV-1）的快速检测，本试验针对DAstV-1（WF1202株）保守区域设计特异性引物，建立了基于染料sybr greenⅠ的实时荧光定量PCR（qPCR）方法，利用所建方法对临床样本进行检测，并将其应用于阳性样本病毒的分离和鉴定。结果表明所建qPCR检测方法的检测下限为4.64×10～3拷贝/μL,高于普通RT-PCR方法10倍；对禽类其他常见病原均为阴性，特异性良好；批内、批间变异系数（Cv）分别为0.85%～2.85%和0.21%～2.94%,均低于3.00%,表明其重复性良好。利用该方法对2020-2022年间10省份不同鸭场的35份组织病料进行检测，阳性率为25.71%（9/35）,与普通RT-PCR检测结果的符合率为94.29%。任取1份阳性病料接种健康鸭胚进行病毒的分离，收集尿囊液利用所建qPCR方法进行检测，确定为阳性后接种1日龄健康雏鸭进行动物回归试验，感染雏鸭呈现一过性发病但未出现死亡，qPCR检测DAstV-1均为阳性，剖检可见肝脏有轻微出血，病理组织学观察发现肝细胞空泡变性，说明所分离的DAstV-1毒株致病性较弱。综上，本试验成功建立了DAstV-1的荧光定量PCR检测方法，可为DAstV-1的临床诊断、分离鉴定及分子流行病学监测等提供技术支撑。

关键词：鸭星状病毒1型分离鉴定诊断方法 sybr greenⅰ染料

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弓形虫半巢式PCR实时荧光检测方法的建立

农业生物技术学报 2023年第12期31卷 2665-2673页

作者：陈梦陶朱龙佼刘海燕许文涛华北理工大学公共卫生学院中国农业大学营养与健康系/食品精准营养与质量控制教育部重点实验室中国农业大学食品科学与营养工程学院转基因生物安全性评价(食品安全)重点实验室/食品质量与安全北京实验室天津体育学院运动营养与健康组学研究中心

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全世界分布的人畜共患寄生虫，在猪(Sus scrofa)和小型家畜中的慢性感染率较高，能够经食源性传播感染人类，对免疫功能较弱的个体会造成极大的危害。本研究根据GenBank公布的弓形虫529 bp基因序列(DQ77... 详细信息

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全世界分布的人畜共患寄生虫，在猪(Sus scrofa)和小型家畜中的慢性感染率较高，能够经食源性传播感染人类，对免疫功能较弱的个体会造成极大的危害。本研究根据GenBank公布的弓形虫529 bp基因序列(DQ779191.1)设计了一组特异性引物，基于sybr greenⅰ染料建立了半巢式PCR实时荧光法对弓形虫进行检测。第一轮扩增利用外引物扩增弓形虫529 bp重复序列，第二轮则结合sybr greenⅰ染料利用内引物对529 bp基因片段进行实时荧光扩增，其最终产物片段长度为260 bp。在优化后的最佳反应条件下，该方法的检测限为18.4 fg/μL，灵敏度较高；与细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、猪肉绦虫(Taenia solium)基因组均无交叉反应，特异性较强。因此，本研究成功建立了灵敏度高、特异性强的半巢式PCR实时荧光检测方法，为监测家畜及肉类食品中弓形虫感染情况提供了有效的技术手段。

关键词：半巢式PCR sybr greenⅰ染料弓形虫实时荧光检测

D型流感病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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黑龙江畜牧兽医 2023年第18期 83-89,137页

作者：王旭阳卢刚程娇娇蔡思棋钟林涛赖志颖贾斌徐亮欧嘉俊肖雨晴胡学瑞王芳赖悯婷邵冉郑飞燕远立国华南农业大学兽医学院/广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室广州510642 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院黑龙江齐齐哈尔161006

为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一... 详细信息

为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一变量法对RT-qPCR反应条件中的引物浓度和退火温度进行优化,建立了一种可检测IDV的RT-qPCR方法,并对该方法的灵敏度、重复性和特异性进行检测,最后应用该方法进行临床样本检测。结果表明:所建立的RT-qPCR方法的最佳引物浓度和退火温度分别为400 nmol/L和61℃,标准曲线为y=-3.572x+42.02(R^(2)=0.9993);该方法能检测到的最低拷贝数为8.30×10^(1)copies,灵敏度是常规PCR的100倍左右;组内重复和组间重复变异系数(CV)值均小于3%;同时检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛疱疹病毒4型(BHV-4)和牛流行热病毒(BEFV)的结果均为阴性;应用该方法对收集到的244份有呼吸道症状的牛鼻拭子样品进行检测,阳性率为1.23%。说明成功建立了IDV RT-qPCR检测方法,该方法具有灵敏度高、重复性和特异性好的特点,为IDV的防控提供了可靠的技术支撑。

关键词： D型流感病毒(IDV) 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) sybr greenⅰ染料方法建立临床检测

鸡Caspase-1基因sybr greenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2021年第5期43卷 521-526页

作者：郭慧芳李宁王白玉乔麒龙黄庆李永涛王增赵军河南农业大学动物医学院河南郑州450046

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、... 详细信息

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因sybr green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10^(3)拷贝/μL~1.0×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10^(2)拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%~4.41%和0.37%~0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。

关键词：鸡Caspase-1基因 sybr greenⅰ染料荧光定量PCR 标准曲线检测

几种主要的猪病毒性疾病多重sybr greenⅠ荧光定量PCR检测方法的研究

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几种主要的猪病毒性疾病多重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的...

作者：韩志涛河南农业大学

学位级别：硕士

猪瘟病毒(Hog cholera virus, HCV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起母猪繁殖障碍的4种主要病原体;引起种猪不育,即公猪睾丸肿胀,精液质量下降,失去种用能力;母猪表现为不发情,返情,不孕;妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等,给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。在动物流感中,猪流感是除禽流感以外经济意义最大,而且公共卫生意义特别重要。2009年墨西哥爆发的猪流感疫情导致数百人死亡,并且,猪流感引起的人类流感迅速在世界上传播开来。所以,猪流感的预防和控制密切关系到人类的公共卫生安全。目前,针对以上5种病毒病的诊断方法有很多,但这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点;虽然临床已经使用的PCR诊断技术,有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点,但会出现假阴性;而TaqMan荧光定量PCR方法能定量,但成本较高,且需要合成特异性探针。亟需研究开发成本低、简便、快速、特异、定量的检测方法。近年来这5种病多呈混合感染,为此,我们做了以下研究:(一)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、伪狂犬病毒的gH基因序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型三重sybr green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测183拷贝猪瘟质粒、231拷贝猪伪狂犬病毒质粒和203拷贝猪圆环病毒2型质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验表明:所建立的三重sybr green定量PCR技术能够有效检测和诊断这三种病毒,有利于这三种病毒混合感染的早期预防和治疗。(二)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因组序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型三重sybr green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测177拷贝猪瘟病毒质粒、202拷贝猪繁殖与呼吸综合征病毒质粒和181拷贝猪圆环病毒2型质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒。试验表明:所建立的三重sybr green定量PCR技术能够有效检测和诊断这三种病毒,有利于这三种病毒混合感染的早期预防和治疗。(三)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因组序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列、猪流感病毒H9亚型,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒四重sybr green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测173拷贝猪瘟病毒质粒、196拷贝猪繁殖与呼吸综合征病毒质粒、203拷贝猪圆环病毒2型质粒和211拷贝猪流感病毒质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒。试验表明:所建立的四重sybr green定量PCR技术能够有效检测和诊断这四种病毒,有利于这四种病毒混合感染的早期预防和治疗。

关键词：猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合症病毒猪伪狂犬病毒猪细小病毒猪圆环病毒2型猪流感病毒 sybr greenⅰ染料多重荧光定量PCR 检测鉴别诊断