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STEAP蛋白与自噬性stx17、VAMP8蛋白相互作用的研究

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STEAP蛋白与自噬性STX17、VAMP8蛋白相互作用的研究

作者：欧阳芹芹南京农业大学

学位级别：硕士

自噬是细胞内的一种清除机制,可以包裹需要降解的物质与溶酶体融合,降解聚集的蛋白质、损伤的细胞器等。Syntaxin 17(stx17)通过与SNAP29蛋白和溶酶体蛋白VAMP8结合形成复合体而介导自噬体-溶酶体融合。STEAP蛋白是一种已知参与自噬的... 详细信息

自噬是细胞内的一种清除机制,可以包裹需要降解的物质与溶酶体融合,降解聚集的蛋白质、损伤的细胞器等。Syntaxin 17(stx17)通过与SNAP29蛋白和溶酶体蛋白VAMP8结合形成复合体而介导自噬体-溶酶体融合。STEAP蛋白是一种已知参与自噬的新蛋白,但其在自噬中机制尚未阐明。因此,我们想通过验证STEAP蛋白是否与stx17及VAMP8蛋白具有相互作用,来完善STEAP在细胞中的作用机制。其中STEAP、stx17、VAMP8基因的物种来源均为人。为了验证STEAP蛋白与stx17/VAMP8之间的相互作用,我们用免疫共沉淀试验和in vitro pull down试验来探究STEAP蛋白与stx17/VAMP8之间的相互作用。首先,利用免疫共沉淀技术探究STEAP蛋白与自噬性stx17、VAMP8蛋白在细胞内的相互作用。将真核表达的质粒:pMRX-3×FLAG-stx17、pMRX-GFP-VAMP8、pTY-3×FLAG-STEAP、pMRX-GFP-STEAP(真核表达质粒均为实验室之前构建保存)利用转染试剂PEI转染至293T细胞中以验证细胞内相互作用。由于在细胞内蛋白质之间的相互作用错综复杂,用免疫共沉淀技术检测到的相互作用可能是蛋白质之间的间接相互作用,而蛋白质行使功能时,往往需要形成一个复合物,因此需要进一步检测STEAP蛋白与自噬性stx17、VAMP8蛋白的直接相互作用。因此通过in vitro pull down试验验证其直接相互作用。in vitro pull down试验需要将欲探究相互作用的蛋白体外纯化。则需要通过PCR技术以及无缝连接技术构建原核表达质粒。以真核表达质粒为扩增模板扩增目的片段,利用无缝连接技术来构建蛋白纯化所需的原核表达质粒:pGEX-4T-1-GST-FLAG-VAMP8、pGEX-4T-1-GST-FLAG-stx17、pET28a-His-STEAP。体外纯化蛋白利用亲和层析纯化方法纯化。亲和层析纯化方法对于将诱导蛋白表达的条件十分敏感,因此先通过少量诱导实验优化蛋白纯化条件。将原核表达质粒pGEX-4T-1-GST-FLAG-VAMP8、pGEX-4T-1-GST-FLAG-stx17、pET28a-His-STEAP转入大肠杆菌T7中表达,以16℃、28℃、37℃的温度诱导蛋白表达,得知蛋白在16℃的诱导温度下表达最好。三个目标蛋白通过亲和层析方法,按照优化的诱导条件诱导蛋白表达,通过考马斯亮蓝染色鉴定结果,表明得到高度纯化的蛋白质,可以用于检测蛋白质之间的相互作用。最后利用已经纯化所得的蛋白质进行GST pull-down试验,验证了 STEAP蛋白与stx17蛋白、VAMP8蛋白具有直接相互作用。在本论文中,成功验证了 STEAP在细胞内与VAMP8和stx17具有相互作用;通过PCR扩增技术以及无缝连接技术成功克隆了原核表达质粒;找到了纯化STEAP,VAMP8和stx17蛋白的合适诱导条件;纯化了 His-STEAP融合蛋白、GST-FLAG-stx17融合蛋白、GST-FLAG-VAMP8融合蛋白,并证实了 STEAP与stx17、VAMP8蛋白具有直接相互作用。这些研究结果为进一步研究自噬融合机理提供了新思路,并奠定了实验基础。其次,完善了 STEAP蛋白在细胞中的功能研究,证实了无论是细胞内还是体外,STEAP与stx17蛋白、VAMP8蛋白都具有相互作用。

关键词： SNAREs STEAP stx17 VAMP8 相互作用细胞自噬

BMAL1调控stx17诱导海马神经细胞自噬体与溶酶体融合在Aβ异常沉积中的机制研究

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BMAL1调控STX17诱导海马神经细胞自噬体与溶酶体融合在Aβ异常沉...

作者：周秀雅山西医科大学

学位级别：硕士

随着人口老龄化进程的加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的患病率逐年升高。截至2021年底,我国每100名老年人中便有3.75人患有阿尔茨海默病。并且该病的致死率也在不断攀升,位列2019年中国主要疾病死因排行榜第5位。然而目前... 详细信息

随着人口老龄化进程的加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的患病率逐年升高。截至2021年底,我国每100名老年人中便有3.75人患有阿尔茨海默病。并且该病的致死率也在不断攀升,位列2019年中国主要疾病死因排行榜第5位。然而目前尚无有效的治疗方法,因此对其发病机制的深入研究显得尤为重要。AD的主要病理改变是大脑皮质和海马内出现了β淀粉样蛋白(Amyloidβpeptide,Aβ)和Tau变性蛋白聚集体。目前认为Aβ聚集在AD疾病进程中发挥着关键作用,Aβ可以诱导神经元发生进行性不可逆性损伤,从而导致认知功能障碍和记忆力减退。其中,Aβ的产生和清除失衡是导致Aβ异常累积的重要原因。研究表明,细胞外Aβ的聚集与细胞内Aβ的异常沉积密切相关,且细胞内Aβ毒性作用的出现甚至早于细胞外Aβ。细胞内Aβ是由其前体蛋白APP(Amyloid precursor protein)在细胞器膜上经过β-分泌酶和γ-分泌酶剪切或内吞细胞外Aβ形成;主要通过细胞自噬、内体/溶酶体降解和泛素-蛋白酶体系统(UPS)清除。然而在AD患者脑中,Aβ的清除速率明显降低,因此如何提高Aβ的清除速率成为拟解决的关键问题。自噬作为Aβ清除的重要途径,具有重要的神经保护功能,自噬体形成后,通过与溶酶体融合清除胞内受损和有毒性作用的蛋白质,阻止神经元丢失延缓AD的发病进程。研究发现AD患者轴突末端存在大量异常累积的自噬体,提示AD进程中自噬流受阻。本研究第一部分通过检测APP/PS1双转基因小鼠海马组织以及APP过表达的小鼠海马神经细胞HT22等AD模型自噬指标和Aβ发现,AD模型中存在Aβ异常沉积和自噬阻滞现象,且电镜观察APP/PS1双转基因小鼠海马组织发现神经元内存在大量自噬小体和少量自噬溶酶体,提示自噬阻滞可能与自噬体和溶酶体融合障碍相关,但具体机制不清。因此,本研究第二部分通过生物信息学分析,发现AD患者脑中与自噬体和溶酶体融合的显著差异因子突触融合蛋白17(Syntaxin17,stx17)。stx17每个结构域均含有甘氨酸拉链状结构,两个跨膜结构域共同形成独特的发夹结构,可实现对自噬体的定位。stx17通过与可溶性NSF粘附蛋白29(Soluble NSF attachment protein 29,SNAP29)和囊泡相关膜蛋白8(Vesicle-associated membrane protein 8,VAMP8)结合形成SNARE复合体,在细胞自噬体和溶酶体的融合过程中发挥着重要作用,其中stx17是SNARE复合体形成的始动因素和关键因子。本研究第二部分通过检测stx17发现,stx17在AD模型中表达量降低。进一步敲低stx17后自噬流阻滞,Aβ异常沉积增多;而过表达stx17后,发现SNARE复合体形成增多促进自噬流恢复使Aβ异常沉积减少,推测AD模型中神经细胞stx17的转录抑制是引起自噬体与溶酶体融合障碍的重要因素。但是,目前AD进程中导致stx17转录下调的机制目前尚不清楚。研究发现,AD患者早期即可出现睡眠-觉醒周期破坏等昼夜节律紊乱症状。昼夜节律以24小时为周期,其产生和维持由生物钟相关基因调控,即正调控元件(BMAL1、CLOCK)和负调控元件(PER、CRY)组成转录翻译水平的负反馈调节通路(Transcriptional-Translational Feedback Loop,TTFL)。其中,自噬节律受生物钟昼夜节律调控,而stx17属于钟控基因(Clock-controlled genes,CCGs),在生物钟基因下游受昼夜节律输出信号的调控。进一步在调控基因组研究中发现,stx17不受CLOCK的调控,而受BMAL1调控。BMAL1蛋白作为正调节因子,可以进入细胞核调控下游因子的转录,提示BMAL1蛋白对stx17转录调控的可能性。本研究第三部分通过Motif预测BMAL1与stx17的结合位点,通过双荧光素酶报告技术观察BMAL1与stx17的结合情况,发现BMAL1可以结合在stx17启动子上,调控stx17的转录。综上所述,本研究提出stx17是调控自噬体与溶酶体融合的关键因子,BMAL1蛋白可以促进stx17转录诱导stx17-SNAP29-VAMP8复合体形成,从而通过自噬清除Aβ,延缓AD发病进程。本研究拟从自噬和生物节律的角度对阿尔茨海默病的机制进行分析,旨在为开发AD治疗药物提供新策略。第一部分AD过程中海马神经细胞可出现自噬体和溶酶体融合障碍及Aβ异常沉积研究目的:探究AD过程中海马神经细胞自噬体与溶酶体融合障碍及细胞内Aβ累积情况。研究方法:(1)实验动物分组和收集海马组织:选取同月龄(4月龄,8月龄)的雄性WT小鼠和APP/PS1双转基因小鼠取海马组织。(2)AD细胞

关键词：阿尔茨海默病海马自噬体溶酶体融合 Aβ stx17 SNAP29 昼夜节律 BMAL1

Beclin1在宫颈癌SiHa细胞中对stx17介导的自噬的影响

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Beclin1在宫颈癌SiHa细胞中对STX17介导的自噬的影响

作者：许淼山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨人乳头瘤病毒16感染的宫颈癌SiHa细胞中自噬溶酶体关键蛋白stx17的表达水平,探讨Beclin1对宫颈癌SiHa细胞中自噬溶酶体关键蛋白stx17介导的自噬的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白印迹实验法检测SiHa细胞、C33... 详细信息

目的:探讨人乳头瘤病毒16感染的宫颈癌SiHa细胞中自噬溶酶体关键蛋白stx17的表达水平,探讨Beclin1对宫颈癌SiHa细胞中自噬溶酶体关键蛋白stx17介导的自噬的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白印迹实验法检测SiHa细胞、C33A细胞中的stx17的m RNA和蛋白表达水平。通过慢病毒转染技术在SiHa细胞中稳定过表达Beclin1,设空白对照组SiHa细胞、阴性对照组SiHa-NC细胞、过表达组SiHaBeclin1细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白印迹实验法检测SiHa、SiHaNC、SiHa-Beclin1细胞中的stx17的m RNA和蛋白表达水平。采用CCK8实验法检测SiHa、SiHa-NC、SiHa-Beclin1细胞的增殖活性;采用细胞划痕实验法测定C33A、SiHa、SiHa-NC、SiHa-Beclin1细胞的迁移能力。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行统计学分析,两独立样本符合方差齐时采用t检验,多组间多重比较采用LSD-t检验,检验水准为α=0.05。结果:(1)实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,与C33A细胞相比,SiHa细胞的stx17 m RNA相对表达水平较C33A细胞低(Pstx17 m RNA相对表达水平较SiHa-NC细胞高(P=0.0005);与SiHa细胞相比,SiHa-Beclin1细胞的stx17 m RNA相对表达水平较SiHa细胞高(P=0.0005)。(2)蛋白印迹实验结果显示,与C33A细胞相比,SiHa细胞的stx17蛋白相对表达水平较C33A细胞低(P=0.0087);与SiHa-NC细胞相比,SiHa-Beclin1细胞的stx17蛋白相对表达水平较SiHa-NC细胞高(P=0.0236);与SiHa细胞相比,SiHaBeclin1细胞的stx17蛋白相对表达水平较SiHa细胞高(P=0.0330)。(3)CCK8实验结果显示,与SiHa-NC细胞相比,刺激24h后,SiHa-Beclin1细胞与SiHa-NC细胞相比差异无统计学意义(P=0.5571);刺激48h后,SiHa-Beclin1细胞增殖活性降低(P=0.0160);刺激72h后,SiHa-Beclin1细胞增殖活性显著降低(P17);与SiHa细胞相比,SiHa-Beclin1细胞在24h细胞迁移能力降低(P=0.0239),48h细胞迁移能力明显降低(Pstx17的表达水平较低,提示自噬受抑。(2)Beclin1过表达后,宫颈癌SiHa细胞中stx17的表达水平上升,提示Beclin1在宫颈癌SiHa细胞中对stx17介导的自噬起促进作用。

关键词：宫颈癌自噬 Beclin1 人乳头瘤病毒 stx17

麦洼牦牛保种群遗传结构及其毛色相关基因stx17的克隆、表达谱分析

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麦洼牦牛保种群遗传结构及其毛色相关基因STX17的克隆、表达谱分析

作者：马士龙西南民族大学

学位级别：硕士

麦洼牦牛是肉奶兼用型青藏高原优良地方牦牛品种,本研究对四川省龙日种畜场内3个麦洼牦牛保种群群体(全黑、粉嘴和弗洛群)进行GBS简化基因组测序;基于SNPs信息,探究麦洼牦牛保种群的遗传多样性及其遗传结构,并进行群体间的选择压力分析... 详细信息

麦洼牦牛是肉奶兼用型青藏高原优良地方牦牛品种,本研究对四川省龙日种畜场内3个麦洼牦牛保种群群体(全黑、粉嘴和弗洛群)进行GBS简化基因组测序;基于SNPs信息,探究麦洼牦牛保种群的遗传多样性及其遗传结构,并进行群体间的选择压力分析和毛色候选基因的关联分析。主要结果如下:1、从麦洼牦牛群体中测序得到1,628,805个SNP位点,获得较多基因组遗传变异数据,测序覆盖的基因组范围较广。3个保种群之间的观测杂合度相近,总个麦洼牦牛群的平均观测杂合度接近于平均期望杂合度;结合连锁不平衡结果表明3个保种群体是中度杂合群体,都处于遗传平衡状态,受外来因素的影响较小,三者的遗传变异程度一致。粉嘴和全黑群的遗传距离和遗传分化指数均最大,结合主成分分析、系统进化树和群体结构分析表明三个群有血缘纯正个体可单独分群,粉嘴群和全黑群有分化现象,仅全黑群存在少部分个体血缘交叉和离群现象。近些年,龙日种畜场的3个群不仅固定了原有的典型外貌,群内血缘也逐渐纯正,说明开放式群体继代选育的保种选育方法是合理的,但在群体继代选育过程仍需严格把关优秀种公牛质量及系谱信息。2、运用F和Pi法对3个麦洼牦牛保种群体进行受选择信号分析,弗洛群和粉嘴群、全黑群受选择区域分别有646、632个基因组区域和105、111个显著差异基因(top 5%为阈值标准),这些基因参与免疫防御、神经行为、运输功能等调控,经GO富集和KEGG通路分析发现,这些基因主要富集在细胞响应DNA损伤的刺激、泛素蛋白连接酶活性、内质网组织和氯离子通道复合物等条目,以及GABA能突触、脂肪酸生物合成、催产素信号通路、血管平滑肌收缩、下丘脑促性腺激素释放激素分泌等方面的通路;这些基因包括全黑群的肌肉发育相关基因MEF2和MSRA,与粉嘴群的繁殖生理相关基因PIWIL4、ESR1以及全黑群的CPQ、PPP3CC等,与三个群的免疫疾病相关基因ZNF385B、TRIM14和SETD8等,及三个群的毛色相关基因stx17、NR4A3和粉嘴群的GNAQ、全黑群的KIT,这些基因与保种群体优良生产性能密切相关,为进一步探究麦洼牦牛群体进化的机制提供了一个新线索。3、三个保种群的选择信号区都锁定到了毛色相关基因突触融合蛋白stx17,成功克隆其ORF序列长度为909 bp,编码302个氨基酸,分析发现该基因的两个跨膜域形成一个发夹结构,定位于自噬小体上;stx17在心、脾、皮肤等6种组织中广泛表达,在灰色皮肤中表达量高于黑色皮肤。本研究利用GBS技术揭示了麦洼牦牛3个保种群的遗传多样性和遗传结构,粉嘴群和全黑群有遗传分化趋势,分群的效果得到了体现;群体间选择信号分析出105和111个差异基因,保种群在毛色、免疫、繁殖性状上经历了人工选择;并通过荧光定量PCR实验证明stx17基因与麦洼牦牛毛色形成相关,这为麦洼牦牛的保种选育工作提供重要的参考资料。

关键词：麦洼牦牛保种群 GBS简化基因组测序群体结构遗传多样性毛色 stx17

自噬性SNARE蛋白stx17的表达、纯化及功能验证

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自噬性SNARE蛋白STX17的表达、纯化及功能验证

作者：张圣薇南京农业大学

学位级别：硕士

自噬是一种保守的分解代谢途径,其在清除受损细胞器、处理聚集的蛋白质、维持细胞动态平衡等过程中起着关键性的作用。自噬的过程主要分为以下阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体融合,内容物降解。鉴于其中几... 详细信息

自噬是一种保守的分解代谢途径,其在清除受损细胞器、处理聚集的蛋白质、维持细胞动态平衡等过程中起着关键性的作用。自噬的过程主要分为以下阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体融合,内容物降解。鉴于其中几个阶段已被广泛深入研究,本实验侧重于自噬体与溶酶体膜融合阶段的分子机制。SNAREs作为必需蛋白质在细胞膜融合的过程中发挥着重要作用,其可组装成一种反式SNARE复合体,即形成平行的四α-螺旋束以驱动膜融合。stx17是自噬体上的Qa-SNARE,VAMP8是溶酶体上的R-SNARE,研究表明在细胞实验中,stx17与VAMP8相互作用介导自噬体膜与溶酶体膜融合阶段。因此本实验使用纯化蛋白在体外实验中进一步验证两者的相互作用。首先应用生物学相关软件对stx17基因进行生物学分析,即预测和分析其氨基酸基本信息、编码蛋白的二级结构等相关信息。接着对重组质粒先转化后进行表达,主要从IPTG终浓度、诱导时间和诱导温度三个方面确定stx17融合蛋白的最优表达条件,纯化后的stx17蛋白经考马斯亮蓝染色、Western Blot进行鉴定。通过in vitro GST Pull down方法对纯化的stx17和VMP8蛋白的相互作用进行验证。本研究的实验结果显示:stx17的基因序列为909bp,编码303个氨基酸（终止子在内）。20种氨基酸中,碱性氨基酸占15.23%,酸性氨基酸占14.24%。含硫氨基酸（Cys、Met）有10个,显示该蛋白质存在二硫键。stx17编码的蛋白质在亲水与疏水区域交替出现,高疏水区域可能形成跨膜结构。二级结构中β转角（T）仅仅占5.17%,而α螺旋（H）为主导,占91.37%。蛋白最优表达体系为:IPTG终浓度0,2 mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃。考马斯亮蓝染色和Western Blot结果显示pGEX-stx17表达的融合蛋白分子量在63 KD附近,经TEV酶切割目的蛋白,纯化好的蛋白分子量在37 KD附近。纯化出的stx17蛋白与VAMP8蛋白之间的相互作用明显。

关键词：自噬膜融合 stx17 原核表达纯化

宫颈癌SiHa细胞中自噬相关蛋白stx17的表达及意义

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宫颈癌SiHa细胞中自噬相关蛋白STX17的表达及意义

作者：吴桐桐山西医科大学

学位级别：硕士

目的:(1)探讨在宫颈癌SiHa细胞中HPV与自噬溶酶体关键蛋白stx17的相关性。(2)探索stx17对宫颈癌SiHa细胞自噬、增殖及侵袭能力的影响。方法:采用qRT-PCR、Western blot法分别检测宫颈癌C33A细胞、SiHa细胞中stx17的mRNA及蛋白表达水平... 详细信息

目的:(1)探讨在宫颈癌SiHa细胞中HPV与自噬溶酶体关键蛋白stx17的相关性。(2)探索stx17对宫颈癌SiHa细胞自噬、增殖及侵袭能力的影响。方法:采用qRT-PCR、Western blot法分别检测宫颈癌C33A细胞、SiHa细胞中stx17的mRNA及蛋白表达水平并分析其表达差异;通过慢病毒转染宫颈癌SiHa细胞后,设置对照组为未做任何处理的SiHa细胞(Control组),实验组为感染stx17过表达空载体慢病毒的SiHa细胞(SiHa-NC组)、感染过表达stx17慢病毒的SiHa细胞(SiHa-OE组)。采用qRT-PCR法检测自噬溶酶体相关因子LAMP-1、LAMP-2的mRNA表达水平;采用Western blot法检测自噬溶酶体相关因子LAMP-1、LAMP-2的蛋白表达水平;采用CCK-8法检测SiHa细胞的增殖活性;采用划痕实验分析Siha细胞在24h及48h的迁移能力;应用Graph Pad Prism9软件进行统计学分析,符合正态分布且方差齐的两独立样本间采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,设α=0.05。结果:(1)qRT-PCR试验:与C33A细胞株相比,SiHa细胞株中的stx17 mRNA表达水平较低(Pstx17蛋白表达水平降低(P=0.037);与Control组相比,SiHa-NC组LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平无显著差异(P=0.996,P=0.5155);与Control组、SiHa-NC组分别相比,SiHa-OE组的LAMP-1蛋白表达水平均升高(P=0.0274,P=0.0303),LAMP-2蛋白表达水平均升高(P=0.0109,P=0.0408);(3)CCK-8试验:与Control组相比,SiHa-NC组分别在24h、48h、72h、96h的增殖能力均无明显变化(P=0.9984,P=0.9431,P=0.4779,P=0.0872);分别与Control组、SiHa-NC组相比,SiHa-OE组在24h的增殖能力均较低(P=0.6414,P=0.6748),在48h的增殖能力均较低(P=0.0303,P=0.0133),在72h的增殖能力均较低,有统计学差异(Pstx17的表达水平较低,提示HPV感染抑制宫颈癌细胞中自噬溶酶体的融合;(2)在过表达stx17的SiHa细胞中LAMP-1/2表达水平较高且细胞的增殖活性及迁移能力降低,提示stx17可能通过下调LAMP1/2的表达,使自噬体与溶酶体融合受抑,最终促进宫颈癌的发生发展。

关键词：宫颈癌细胞自噬人乳头瘤病毒 stx17

突触融合蛋白17改善Aβ31-35诱导的小鼠海马神经细胞死亡

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陆军军医大学学报 2022年第17期44卷 1712-1719页

作者：王宁周秀雅何星鸿张立飞李朋佳师姝王丽王晓晖山西医科大学基础医学院病理教研室太原030001 山西医科大学基础医学院基础医学研究中心太原030001

目的探究突触融合蛋白17(syntaxin17,stx17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用。方法基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的A... 详细信息

目的探究突触融合蛋白17(syntaxin17,stx17)在Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡中的作用。方法基于WGCNA方法选取与阿尔茨海默病显著相关的基因,与自噬基因库和SNARE家族基因取交集筛选关键基因;C57BL/6小鼠海马组织中注射浓度为1 g/L的Aβ31-35和使用终浓度为5μmol/L Aβ31-35处理HT22海马神经细胞,采用Western Blot检测stx17、LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况;CCK-8法检测Aβ31-35处理的HT22海马神经细胞存活率;慢病毒介导HT22海马神经细胞stx17过表达后,Western blot检测Aβ31-35处理后LC3Ⅱ、P62的蛋白表达情况。结果与阿尔茨海默病显著相关的Salmon和Black模块分别与自噬基因库和SNARE亚家族取交集获取关键基因stx17。与对照组比较,经Aβ31-35处理后,HT22细胞细胞存活率[(81.81±11.65)%]明显下降(Pstx17蛋白表达均显著降低(Pstx17过表达后,显著逆转Aβ31-35诱导的LC3Ⅱ、P62的蛋白表达上调(Pstx17通过促进自噬来改善Aβ诱导的小鼠海马神经细胞死亡。

关键词： stx17 Aβ 小鼠海马神经细胞细胞死亡自噬

Syntaxin17在自噬膜融合中的作用及调控机制的研究进展

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中国兽医科学 2022年第4期52卷 531-536页

作者：赵玉梦曲华艺卞宇生刘宗平邹辉扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

自噬是一种细胞自我降解和循环利用胞内组分的过程,对细胞应对外界环境变化、维持自身稳态至关重要。目前有关自噬的作用与机制已经有了广泛的研究,SNARE蛋白(SNAREs)参与自噬的整个过程,是自噬过程中物质运输及膜融合的关键蛋白。Synta... 详细信息

自噬是一种细胞自我降解和循环利用胞内组分的过程,对细胞应对外界环境变化、维持自身稳态至关重要。目前有关自噬的作用与机制已经有了广泛的研究,SNARE蛋白(SNAREs)参与自噬的整个过程,是自噬过程中物质运输及膜融合的关键蛋白。Syntaxin17(stx17)是SNARE蛋白中重要的蛋白之一,也是目前研究较为广泛的一个蛋白。本文将近年来stx17对自噬调控的相关进展进行综述,为后续研究自噬的机制提供参考。

关键词：自噬 SNARE蛋白 stx17 膜融合

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SCFD1蛋白互作研究

SCFD1蛋白互作研究

作者：孙家丽南京农业大学

学位级别：硕士

自噬是指自我吞噬,将细胞质中错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等运送至溶酶体中进行降解,是一种高度保守的自我进化过程。自噬过程主要为启动自噬、隔离膜的形成与延伸、自噬体的形成、自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合以及溶酶体中... 详细信息

自噬是指自我吞噬,将细胞质中错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等运送至溶酶体中进行降解,是一种高度保守的自我进化过程。自噬过程主要为启动自噬、隔离膜的形成与延伸、自噬体的形成、自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合以及溶酶体中货物的降解。目前大多数研究主要集中在自噬体的形成阶段,但是细胞内的货物只有在自噬体与溶酶体融合后,才能够进入溶酶体中发生降解,所以自噬体与溶酶体的融合也是自噬过程中非常重要的步骤。研究发现,stx17蛋白和SCFD1蛋白是自噬过程中自噬体-溶酶体融合步骤的两种重要的蛋白质。stx17蛋白是一种自噬性Qa-SNARE蛋白,可进一步与其他SNARE蛋白SNAP29和VAMP8结合形成stx17-VAMP8-SNAP29复合物促进自噬体-溶酶体的融合。SCFD1蛋白是一种SM蛋白,被证明可参与stx17-VAMP8-SNAP29复合物的组装并与后者一起调控自噬体-溶酶体的融合。然而,最近在对自噬机制的研究中,通过细胞内的免疫共沉淀（CO-IP）试验发现stx17蛋白和SCFD1蛋白存在相互作用,但是这种相互作用是细胞内的其他蛋白介导的还是两种蛋白质之间的直接作用,这一问题并不明确,需要进一步探究。为了探究自噬蛋白SCFD1和stx17之间的直接相互作用,本文主要研究方法与结果如下:1.采用基因克隆技术构建stx17和SCFD1重组质粒:PCR技术扩增stx17和SCFD1外源基因片段,限制性内切酶Bam HI和Not I或Bam HI和Asc I分别对大肠杆菌表达载体p GEX-4T-1和p ET28a进行双酶切,采用无缝克隆技术将stx17和SCFD1外源基因分别整合到p GEX-4T-1和p ET28a载体上,进一步转化到大肠杆菌中复制和表达外源目的基因,验证与鉴定序列正确的阳性质粒,最后成功构建p GEX-stx17和p ET28a-SCFD1重组质粒。2.对影响原核表达的两种主要条件——诱导温度和诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度进行条件优化,获得stx17和SCFD1重组蛋白诱导表达的最优条件:将重组质粒转化至大肠杆菌,扩增培养至OD为0.8-1.0时,分别在5个不同的IPTG浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/L）和诱导温度（16℃、20℃、25℃、30℃、37℃）下诱导表达,在IPTG浓度条件优化的基础上进一步优化诱导温度条件,通过可溶性蛋白的表达量和包涵体的形成来确定可以获得较多活性蛋白的最优诱导表达条件,结果发现其可溶性表达最高的诱导表达条件为:stx17重组蛋白:IPTG浓度为0.1mmol/L,温度为37℃;SCFD1重组蛋白:IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为20℃。*** vitro GST pull-down直接相互作用探究:分别以得出的最优IPTG浓度和温度条件诱导表达stx17和SCFD1重组蛋白,以谷胱甘肽琼脂糖树脂或Ni-NTA琼脂糖纯化树脂为介质,利用亲和层析分离法纯化出stx17和SCFD1体外重组蛋白。In vitro GST pull-down试验以谷胱甘肽琼脂糖树脂为介质,以具有GST亲和标签的p GEX-4T-1-GST-Flag-stx17重组蛋白为诱饵蛋白,探究其是否可以下拉p ET28a-His-SCFD1重组蛋白;Western Blot试验分别采用一抗Flag和His标签抗体检测stx17和SCFD1重组蛋白的相互作用。In vitro GST pull-down和Western Blot技术证实了stx17和SCFD1之间的直接相互作用。通过本课题的研究,进一步了解自噬关键参与者stx17蛋白和SCFD1蛋白和自噬体与溶酶体融合的机制,为发现相关疾病治疗的新靶点打下坚实的基础。

关键词： stx17 SCFD1 相互作用蛋白纯化