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spata3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

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畜牧兽医学报 2020年第2期51卷 279-287页

作者：黄向月熊显荣张磊马鸿程海卓李键西南民族大学生命科学与技术学院成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用国家教育部重点实验室成都610041

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3(spermatogenesis associated 3,spata3)基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨spata3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提... 详细信息

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3(spermatogenesis associated 3,spata3)基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨spata3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛spata3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测spata3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测spata3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,spata3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;spata3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,spata3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期(4~5岁)睾丸中的表达极显著高于胎牛时期(5~6月,Pspata3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛(Pspata3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。

关键词：牦牛犏牛 spata3 免疫组化精子发生表达

小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达分析和克隆纯化

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第11期13卷 2024-2028页

作者：李喜霞张栋崔慧林郭睿山西医科大学生物化学与分子生物学教研室山西省太原市030001 山西医科大学组织学与胚胎学教研室山西省太原市030001

背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系。spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因。目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-spata3融合蛋白。... 详细信息

背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系。spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因。目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-spata3融合蛋白。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成。材料:pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株*** DH5α(TaKaRa公司),表达载体pET-41a(+)plasmid DNA(Novagen公司),大肠杆菌菌株*** BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8周龄雄性和8周龄雌性BALB/c小鼠。方法:麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA。通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3mRNA表达及定位;通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达。②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达。③spata3mRNA细胞定位的杂交信号。④spata3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化。⑤重组蛋白的Western blot分析。结果:反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化。DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被高效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的spata3重组蛋白具有高度的特异性。结论:spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要。

关键词： spata3 生精细胞实时荧光定量聚合酶链反应克隆

Interactions between Toxoplasma gondii micronemal protein MIC3 and host proteins spata3 and Dkk2

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Interactions between Toxoplasma gondii micronemal protein MI...

spata3基因参与小鼠生殖细胞发育及其初步功能研究

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者： Yifan Wang Rui Fang Yuan Yuan Ming Pan Min Hu Yanqin Zhou Bang Shen Junlong Zhao State Key Laboratory of Agricultural Microbiology College of Veterinary MedicineHuazhong Agricultural University Key Laboratory of development of veterinary diagnostic products Ministry of AgricultureHuazhong Agricultural University

As an obligate intracellular protozoan,Toxoplasma gondii is a successful pathogen infecting a variety of animals and *** host infection,micronemal proteins(MICs) are released to parasite surface,where they bind host cells to mediate gliding motility and host-cell *** an adhesin,the micronemal protein MIC3 plays important roles in host cell attachment,as well as modulation of host EGFR signaling ***,the specific host proteins that interact with MIC3 are unknown and the identification of such proteins will increase our understanding of how MIC3 exerts its *** this study,we sought to identify host proteins interacting with MIC3 by yeast two-hybrid *** MIC3 as bait,we screened a library expressing mouse proteins and found five mouse proteins that showed positive interactions with *** of which,spermatogenesis-associated protein 3(spata3) and dickkopf-related protein 2(Dkk2),were further confirmed to interact with MIC3 both in vitro and in vivo by additional protein-protein interaction *** also found that the tandem repeat EGF domains of MIC3 were critical in mediating the interactions with the identified host *** is the first study to show that MIC3 interacts with host proteins that are involved in reproduction,growth and *** results will help us to better understand the functions of adhesion-associated micronemal proteins in Toxoplasma gondii.

关键词： Toxoplasma gondii MIC3 Yeast two-hybrid Dkk2 spata3

来源： cnki会议评论

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spata3基因参与小鼠生殖细胞发育及其初步功能研究

作者：温丽敏山西医科大学

学位级别：硕士

目的:明确spata3基因m RNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的特异表达特性;运用分子克隆技术构建spata3的真核表达质粒并建立spata3过表达HEK293T细胞模型;分析spata3过表达HEK293T细胞中细胞凋亡和细胞自噬相关蛋白的表达;进一步构建... 详细信息

目的:明确spata3基因m RNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的特异表达特性;运用分子克隆技术构建spata3的真核表达质粒并建立spata3过表达HEK293T细胞模型;分析spata3过表达HEK293T细胞中细胞凋亡和细胞自噬相关蛋白的表达;进一步构建spata3过表达慢病毒载体并建立稳定表达GC2-spd细胞模型;分析spata3稳定表达GC2-spd细胞中细胞自噬相关蛋白的表达;为进一步探究在精子发生过程中spata3所发挥的的作用及意义奠定基础。方法:1.采用RT-PCR分析spata3基因m RNA在小鼠各组织中的表达;2.利用Western blotting分析spata3蛋白在小鼠各组织中的表达;3.应用免疫组织化学染色检测spata3蛋白在小鼠睾丸组织中的细胞定位;4.通过间接免疫荧光染色观察spata3蛋白在小鼠生精细胞中的定位分布;5.利用分子克隆技术构建spata3真核表达重组质粒p LV-EGFP(2A)Purospata3;6.采用RT-PCR和Western blotting分析重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-spata3转染HEK293T细胞后spata3 m RNA和蛋白的表达水平;7.采用间接免疫荧光染色检测spata3蛋白在过表达HEK293T细胞中的定位分布;8.采用Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Caspase3、PARP、Bax和Bcl-2以及细胞自噬相关蛋白Lc3A/B的表达水平;9.过表达慢病毒载体瞬时感染HEK293T细胞;采用RT-PCR和Western blotting检测spata3在HEK293T细胞中的瞬时表达;10.建立稳定表达spata3的GC2-spd细胞模型;采用RT-PCR和Western blotting检测spata3在GC2-spd细胞中的稳定表达;11.采用Western blotting检测自噬相关蛋白Lc3A/B在spata3稳定表达GC2-spd细胞中的表达水平。12.采用间接免疫荧光染色检测自噬相关蛋白Lc3A/B在spata3稳定表达GC2-spd细胞中的分布。结果:***-PCR结果显示spata3基因m RNA在小鼠睾丸组织特异表达;*** blotting结果显示spata3蛋白在小鼠睾丸组织特异表达;3.免疫组织化学染色结果表明spata3蛋白主要定位在曲精小管内圆形精子细胞、粗线期精母细胞和长形精子细胞中,间质细胞、支持细胞、精原细胞、前细线期精母细胞中未见spata3明显阳性信号;4.免疫荧光分析显示粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞浆与胞核均有显著spata3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞浆也有大量分布;***测序结果表明重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-spata3构建成功;6.重组质粒转染HEK293T细胞后,经RT-PCR和Western blotting检测表明spata3基因在HEK293T内过表达;7.细胞免疫荧光染色分析显示在HEK293T细胞内过表达的spata3蛋白分布广泛,但核周荧光信号明显强于胞核;*** blotting结果表明过表达spata3的293T细胞中细胞凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白Caspase3、PARP无明显变化,Bax、Lc3A/B蛋白水平高于对照组(Pspata3慢病毒载体在HEK293T细胞中过表达,表明慢病毒载体构建成功;***-PCR和Western blotting结果表明spata3慢病毒载体在GC2-spd细胞中过表达,spata3过表达GC2-spd稳定细胞模型构建成功;*** blotting结果表明过表达spata3的GC2-spd稳定细胞中自噬相关蛋白Lc3A/B蛋白含量高于对照组(Pspata3的GC2-spd稳定细胞中自噬相关蛋白Lc3A/B荧光信号在核周呈点状广泛分布;结论:***3基因在小鼠睾丸组织大量表达,并具有生精细胞定位特异性。2.成功建立了spata3稳定过表达GC2-spd细胞模型。***3基因过表达具有促进HEK293T细胞自噬的作用,而与细胞凋亡没有直接关系。spata3基因过表达能够促进GC2-spd细胞自噬,可能与哺乳类动物精子发生期间的生精细胞自噬密切相关。

关键词： spata3 精子发生 HEK293T细胞 GC2-spd细胞细胞自噬

精子发生相关基因spata3剪接体的分子克隆和表达分析

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精子发生相关基因SPATA3剪接体的分子克隆和表达分析

作者：周柏序西南医科大学

学位级别：硕士

目的:克隆新的人spata3基因不同剪接体,探讨其分子生物学特征并分析其蛋白质的时空表达。方法:①以人睾丸cDNA为模板,扩增spata3的cDNA全长,与pGM-T载体克隆获得spata3基因不同剪接体的开放读码框全长基因序列,并经测序验证。②应用 NEB... 详细信息

目的:克隆新的人spata3基因不同剪接体,探讨其分子生物学特征并分析其蛋白质的时空表达。方法:①以人睾丸cDNA为模板,扩增spata3的cDNA全长,与pGM-T载体克隆获得spata3基因不同剪接体的开放读码框全长基因序列,并经测序验证。②应用 NEBcutter V2.0、NCBI、Clustal Omega、WOLF PSORT在线软件对spata3基因不同剪接体进行生物信息学分析。③将上述①所获得的质粒为模板,扩增spata3基因不同剪接体的开放读码框序列,连接至可诱导表达的载体pcDNA5,成功构建重组质粒pcDNA5-spata3-I1、pcDNA5-spata3-I2、pcDNA5-spata3-I3、pcDNA5-spata3-I4。④同样方法如上述③,构建重组质粒pEGFP-C3-spata3-I1、pEGFP-C3-spata3-I2、pEGFP-C3-spata3-I3、pEGFP-C3-spata3-I4。⑤RT-PCR 检测spata3基因不同剪接体 mRNA水平的过表达。⑥用重组质粒 pEGFP-C3-spata3-I1、pEGFP-C3-spata3-I2、pEGFP-C3-spata3-I3、pEGFP-C3-spata3-I4 转染 HeLa 细胞,经 Hoechst 33258染色后检测其各个异构体的亚细胞定位。⑦Western Blot检测spata3基因不同剪接异构体蛋白的过表达。⑧提取成年小鼠多组织及小鼠不同发育阶段的睾丸组织的蛋白,运用Western Blot检测剪接异构体蛋白spata3-I1的时空表达。⑨分别提取2周龄、8周龄、16周龄小鼠睾丸组织,切片,固定,用spata3抗体进行免疫组化分析剪接异构体蛋白spata3-I1在小鼠生精上皮细胞中的表达和定位。结果:①成功克隆spata3基因不同剪接体。②spata3-I1（GenBank接受号:AY032925.1）含有长549bp的完整开放阅读框,编码183个氨基酸的蛋白质;spata3-I2（GenBank 接受号:NM39073.3）含有长 579bp的完整开放阅读框,编码192个氨基酸的蛋白质;spata3-13含有长414bp的完整开放阅读框,编码138个氨基酸的蛋白质;spata3-I4含有长387bp的完整开放阅读框,编码129个氨基酸的蛋白质。③RT-PCR提示spata3基因不同剪接体mRNA水平均有过表达。④亚细胞定位结果提示:不同剪接体的GFP融合蛋白均主要定位在细胞核,不过融合蛋白pEGFP-C3-spata3-I3和pEGFP-C3-spata3-I4的荧光有逐渐聚焦到细胞质、而细胞核荧光减弱的趋势。⑤Western Blot检测结果显示pEGFP-C3-spata3-I1、pEGFP-C3-spata3-12、pEGFP-C3-spata3-I3、pEGFP-C3-spata3-I4融合蛋白均有表达。⑥小鼠多组织蛋白Western Blot检测结果提示剪接异构体蛋白spata3-I1具有显著的睾丸组织特异性表达特征。⑦不同发育阶段雄性小鼠睾丸组织蛋白Western Blot检测结果显示剪接异构体蛋白spata3-11在胚胎及小鼠发育早期不表达,在23天龄至57天龄（约3～8周龄）的小鼠睾丸中均有高表达。⑧免疫组化结果显示剪接异构体蛋白spata3-I1在生精上皮细胞中主要定位在圆形精子细胞和长形精子细胞。结论:①发现了 2个新的人SPA TA3剪接体,分别标记为spata3-I3、SPA TA3-14。②SPA TA3剪接体的mRNA及蛋白均有表达,但它们的亚细胞定位不同。③Western Blot结果提示spata3-I1蛋白具有显著的睾丸组织特异性表达特征,在胚胎及小鼠发育早期不表达,而在23天龄至57天龄（约3～8周龄）的小鼠睾丸中有高表达。免疫组化结果显示剪接异构体蛋白spata3-I1在生精上皮细胞中主要定位在圆形精子细胞和长形精子细胞。因此,我们的结果提示spata3主要与精子发生和成熟相关。

关键词： spata3 剪接体时空表达亚细胞定位精子发生与成熟

小鼠精子发生相关基因spata3的表达分析

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小鼠精子发生相关基因spata3的表达分析

作者：李颖山西医科大学

学位级别：硕士

研究目的：分析小鼠精子发生相关基因spata3mRNA及其编码蛋白产物的表达特性,揭示该基因在精子细胞变态成形过程中的作用,为深入理解男性不育症的发病机理积累实验室资料。研究方法： 1.应用半定量RT-PCR技术分析spata3mRNA... 详细信息

研究目的：分析小鼠精子发生相关基因spata3mRNA及其编码蛋白产物的表达特性,揭示该基因在精子细胞变态成形过程中的作用,为深入理解男性不育症的发病机理积累实验室资料。研究方法： 1.应用半定量RT-PCR技术分析spata3mRNA的组织表达特异性;2.利用实时荧光定量PCR方法分析spata3mRNA在不同周龄小鼠睾丸组织中的差异性表达;3.通过分子克隆技术构建spata3原核表达载体,并实现spata3在大肠杆菌中的可溶性表达;通过亲和层析纯化获得GST-spata3融合蛋白并利用Western blot印迹杂交加以验证;以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗spata3多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性;4.利用免疫组织化学染色分析spata3蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位;5.利用多重间接免疫荧光技术分析spata3蛋白在精子细胞内的亚细胞定位;6.通过免疫共沉淀技术分析spata3蛋白与微管蛋白a-tubulin的相互作用。研究结果： 1.半定量RT-PCR分析表明spata3mRNA具有显著的睾丸组织特异性表达特征;2.实时荧光定量PCR结果显示spata3mRNA在5周龄及8周龄雄性小鼠睾丸组织中高表达,可能与精子发生后期密切相关;3.酶切图谱分析与DNA序列测定表明spata3原核表达载体构建成功,经诱导表达及亲和层析纯化后获得融合蛋白GST-spata3, Western blot印迹杂交证明纯化的重组蛋白具有高度的特异性。ELISA测定显示抗spata3多克隆抗体效价可达1:102,400, Western blot显示该抗体可与spata3蛋白特异结合,具有识别特异性;4.免疫组织化学染色结果显示spata3蛋白在小鼠曲精小管中主要定位在圆形精子细胞和长形精子细胞内;5.多重间接免疫荧光染色分析表明spata3蛋白与精子细胞变态成形过程出现的精子领结构共定位在圆形及长形精子细胞核表面,并伴随精子细胞核的改变而出现形态及定位的动态变化;6.免疫共沉淀实验尚未证明spata3与a-tubulin能够在体外形成免疫沉淀复合物,需利用其他方法进一步验证。研究结论： 1. spata3mRNA在小鼠睾丸组织中高表达,具有显著的组织表达特异性。在5周龄及8周龄小鼠睾丸组织中spata3mRNA处于高水平转录状态,具有显著的阶段特异性表达,提示该基因与精子发生后期过程密切相关;2. spata3蛋白定位在圆形精子细胞和长形精子细胞核周,并且与精子领结构在形态改变及发育时间上具有高度的吻合性,提示该蛋白可能与精子领共同参与了精子细胞核的浓缩变形过程;3. spata3蛋白与a-tubulin能够在体外形成免疫沉淀复合物,说明二者之间存在一定的相互作用,但仍需进一步证明该作用属直接作用还是间接作用。 4.实验证实本课题制备的抗spata3多克隆抗体能特异识别细胞内spata3蛋白,为后期进一步从蛋白水平研究spata3的功能及作用机制提供了实验材料。

关键词： spata3 精子发生精子细胞变态成形精子领

可诱导的稳定表达spata3细胞系的建立及特征(英文)

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细胞生物学杂志 2008年第2期30卷 247-250页

作者：傅俊江曾卫民李月红郭明日中南大学生物科学与技术学院生物化学系中南大学人类生殖与干细胞工程研究所长沙410078 美国贝勒医学院分子与细胞生物学系德克萨斯77030 中南大学职工医院湘雅分院

spata3是一个在睾丸中特异性表达的基因,可能与精子发生或生精细胞凋亡相关。为了进一步研究spata3的功能,将spata3克隆入经修饰的pcDNA5/FRT/TO表达载体,应用Flp-InTMT-RExTM-293细胞系作为宿主细胞,成功地构建了可被四环素或Doxyclin... 详细信息

spata3是一个在睾丸中特异性表达的基因,可能与精子发生或生精细胞凋亡相关。为了进一步研究spata3的功能,将spata3克隆入经修饰的pcDNA5/FRT/TO表达载体,应用Flp-InTMT-RExTM-293细胞系作为宿主细胞,成功地构建了可被四环素或Doxycline诱导的稳定表达Flp-InTMT-RExTM-sptat3的细胞系。该细胞系在spata3基因的3'端有2×FLAGtag和2×Histag,在缺乏可利用的spata3或其抗体的情况下,也能够很容易地应用商品化的FLAG抗体检测到spata3全长蛋白的表达。这种可诱导的稳定表达Flp-InTMT-RExTM-spata3的细胞系的建立,不仅有利于spata3的分析鉴定和功能研究,而且对于其他蛋白质的分离纯化和功能研究也有很好的借鉴作用。

关键词： spata3 稳定细胞系蛋白质表达诱导

弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究

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经济动物学报 2017年第2期21卷 68-74页

作者：刘卿李法财杨文彬刘国华赵权朱兴全湖南农业大学动物医学院吉林农业大学动物科学技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了spata3和Dkk2基因。然后分... 详细信息

为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主spata3和Dkk2蛋白互作。

关键词：弓形虫微线体蛋白蛋白互作 spata3 Dkk2