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sigirr对H292细胞Toll样受体4、5、9致炎作用的影响及机制研究

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免疫学杂志 2009年第3期25卷 243-246页

作者：张椿钱桂生赵云峰吴学玲第三军医大学附属新桥医院呼吸病研究所东南大学附属中大医院呼吸内科

目的观察sigirr(single Ig IL-1R-related molecule)对人气道上皮细胞株H292中Toll样受体(TLR)4、5、9致炎作用的影响,并初步了解其作用机制。方法运用脂质体转染的方法,将sigirr-EGFP融和蛋白真核表达载体稳定转染H292细胞,通过免疫细... 详细信息

目的观察sigirr(single Ig IL-1R-related molecule)对人气道上皮细胞株H292中Toll样受体(TLR)4、5、9致炎作用的影响,并初步了解其作用机制。方法运用脂质体转染的方法,将sigirr-EGFP融和蛋白真核表达载体稳定转染H292细胞,通过免疫细胞化学技术观察H292细胞中sigirr的过表达情况;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006处理后,ELISA检测重组质粒(sigirr-EGFP)、空质粒(pEGFP-N1)转染以及未转染的H292细胞分泌致炎因子TNF-α和IL-6水平;通过免疫共沉淀的方法了解sigirr与MyD88之间的关系。结果激光共聚焦显微镜显示重组融合蛋白sigirr-EGFP与H292内源sigirr共定位于细胞膜上;经LPS、Flagellin、CpGDNA 2006刺激后,重组质粒转染的H292细胞分泌的IL-6和TNF-α水平显著低于空质粒转染和未转染的H292细胞(Psigirr与MyD88有较强相互作用,可与TLR4、5、9竞争结合MyD88分子。结论sigirr对H292细胞TLR4、5、9致炎通路的负性调节作用,可能是通过减少MyD88分子与TLR4、5、9的结合,从而削弱了炎症信号的细胞内转导。

关键词： sigirr MyD88 Toll样受体致炎因子免疫共沉淀

sigirr-EGFP真核表达载体构建及在H292细胞中的亚细胞定位研究

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免疫学杂志 2009年第1期25卷 64-67页

作者：张椿钱桂生赵云峰吴学玲第三军医大学附属新桥医院呼吸病研究所东南大学附属中大医院呼吸内科

目的通过增强型绿色荧光蛋白示踪技术,观察sigirr(single Ig IL-1R-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的分布特点及对上皮细胞天然免疫功能的影响。方法构建sigirr-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法转染人气... 详细信息

目的通过增强型绿色荧光蛋白示踪技术,观察sigirr(single Ig IL-1R-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的分布特点及对上皮细胞天然免疫功能的影响。方法构建sigirr-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法转染人气道上皮细胞株H292,再利用激光共聚焦显微镜对其进行亚细胞定位研究。经LPS刺激后,ELISA检测转染前后上皮细胞TNF-α分泌水平的差异。结果构建的融和蛋白表达载体sigirr-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,电泳显示其条带大小为4.7 kb和1.23 kb左右,经测序证实sigirr的序列与GenBank公布的人cDNA序列完全一致。激光共聚焦显示pEGFP-N1空载体转染表达的绿色荧光蛋白在H292细胞中均匀分布,而重组载体sigirr-EGFP表达的融和蛋白在H292细胞核周(膜)和细胞膜边缘上有连续分布现象。经LPS刺激后,pEGFP-N1转染的细胞和未转染细胞TNF-α水平无显著性差异(P>0.05),而sigirr-EGFP转染细胞与pEGFP-N1转染细胞相比,显著降低了TNF-α的产生(Psigirr分子在H292细胞中细胞膜分布。过表达的sigirr降低了上皮细胞LPS诱导的炎症因子TNF-α产生。

关键词： sigirr 绿色荧光蛋白激光共聚焦

sigirr对IL-1R/TLRs信号通路的负性调控作用研究进展

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中国畜牧兽医 2016年第10期43卷 2640-2647页

作者：周秋格刘畅刘玉辉赖金伦陈颖钰郭爱珍胡长敏华中农业大学动物医学院武汉430070 农业微生物学国家重点实验室武汉430070

单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(sigirr)是TIR超家族成员,最新研究表明它可负性调节IL-1R/TLRs受体介导的固有免疫应答,且在感染性疾病、肿瘤及自体免疫病诱导的炎症反应调节上所起的重要作用已经被阐明。作者主要综述了sigirr基因和... 详细信息

单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(sigirr)是TIR超家族成员,最新研究表明它可负性调节IL-1R/TLRs受体介导的固有免疫应答,且在感染性疾病、肿瘤及自体免疫病诱导的炎症反应调节上所起的重要作用已经被阐明。作者主要综述了sigirr基因和蛋白表达模式在人、小鼠、牛等物种间的差异性,因其结构特异性所具有的对IL-1R/TLRs炎性信号通路的负性调控和具体的调控机理,以及在不同炎性相关疾病的发生和发展中抑制炎性反应的机制,进而为临床的炎性相关疾病治疗提供理论借鉴,同时也拓宽了sigirr基因在动物疾病治疗中的应用范围。

关键词： sigirr TLRs 信号通路负性调控

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sigirr对奶牛乳腺上皮细胞TLR4致炎信号通路的负调控作用

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 404-410页

作者：周秋格刘畅赖金伦郭爱珍胡长敏华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉450070

旨在探究sigirr对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）TLR4信号通路的负调控作用。构建sigirr—pEGFP真核表达载体，脂质体法转染HEK293T及BMECs，荧光显微镜观察及Westernblot验证融合蛋白sigirr—pEGFP的表达；LPS刺激转染后BMECs，检测TLR4及... 详细信息

旨在探究sigirr对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）TLR4信号通路的负调控作用。构建sigirr—pEGFP真核表达载体，脂质体法转染HEK293T及BMECs，荧光显微镜观察及Westernblot验证融合蛋白sigirr—pEGFP的表达；LPS刺激转染后BMECs，检测TLR4及其信号通路分子IRAK1、IRAK4和TRAF6的变化，以及下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-18和TNF-a的表达量。结果显示，成功构建sigirr-pEGFP真核表达载体，荧光检测重组质粒转染到HEK293T和BMECs中；Westernblot鉴定融合蛋白sigirr—pEGFP表达正确；重组质粒转染BMECs后，sigirr表达量较转染空载质粒组及空白未转染组显著升高（P〈0．01）；炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、TNFa、TLR4及下游信号分子IRAK1、IRAK4、TRAF6表达量显著降低（P〈0．01），转染空载质粒组与空白未转染组相比仅IRAKl表达量有差异（P〈0．05）。结果表明，本试验通过研究牛sigirr在BMECs中的作用，证实sigirr基因具有炎性负调控LPS-TLR4信号通路的作用，具有潜力成为临床治疗奶牛乳腺炎的新靶标。

关键词：奶牛乳腺炎乳腺上皮细胞 sigirr TLR4信号通路负性调控

sigirr过表达抑制树突状细胞成熟并诱导同种移植免疫耐受的研究

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中华实验外科杂志 2017年第3期34卷 398-401页

作者：薛志诚卢新军章旭之邓荣海马毅中山大学附属第一医院器官移植中心广州510080

目的观察过表达sigirr基因抑制树突状细胞（DCs）成熟活化、诱导移植免疫耐受的效果.方法体外培养扩增骨髓来源DCs,并借助带绿色荧光蛋白（GFP）荧光的腺病毒载体将sigirr基因转入DCs,分别应用流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）... 详细信息

目的观察过表达sigirr基因抑制树突状细胞（DCs）成熟活化、诱导移植免疫耐受的效果.方法体外培养扩增骨髓来源DCs,并借助带绿色荧光蛋白（GFP）荧光的腺病毒载体将sigirr基因转入DCs,分别应用流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测sigirr基因修饰的未成熟DCs（imDCs）在脂多糖刺激前后细胞表型及功能变化;建立小鼠同种异体胰岛移植模型,术前连续3d受体分别给予尾静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、imDCs、DC-GFP及DC-sigirr,观察各组小鼠胰岛移植物活性及其生存时间,同时在术后第7天取移植物做苏木素-伊红（HE）及免疫荧光检查,比较各组移植物排斥反应强度.结果过表达sigirr的DCs经脂多糖刺激后仍稳定在未成熟状态：低表达人类主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ、CD40、CD80、CD86,分泌低水平白细胞介素（IL）-12[（547.80±84.67）pg/ml,P=0.026]及高水平IL-10[（410.40±36.11）pg/ml,P=0.031],与其他两组差异有统计学意义.术后糖耐量试验提示比较其他对照组,sigirr组血糖峰值更小[（19.0±1.0）mmol/L,P=0.041],胰岛移植物生存时间显著优于其他各组[（14.3±3.6）d,P=0.036].术后免疫组织化学提示sigirr组胰岛移植物活性优于其他对照组.结论 sigirr基因有效抑制未成熟DCs在脂多糖等外源刺激因子作用下的成熟和活化,抑制抗原提呈功能,在一定程度上延长移植物存活时间,诱导移植免疫耐受形成.

关键词： sigirr 基因转染树突状细胞胰岛移植移植排斥

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骨癌痛大鼠髓内sigirr的表达变化

免疫学杂志 2014年第5期30卷 402-406页

作者：张斌白亢亢卞尧尧濮文渊陈轶尘周春祥南京中医药大学伤寒金匮教研室 210023 宁波市医学科学研究所病理科 315000

目的本研究针对目前日益增长的骨癌痛病患的疼痛问题进行试验探讨。建立癌痛动物模型寻找有效缓解疼痛的方法,进一步探讨骨癌痛大鼠模型中髓内细胞蛋白sigirr的表达水平的变化。方法建立SD大鼠胫骨癌痛模型,随机分为空白组(10只)和骨癌... 详细信息

目的本研究针对目前日益增长的骨癌痛病患的疼痛问题进行试验探讨。建立癌痛动物模型寻找有效缓解疼痛的方法,进一步探讨骨癌痛大鼠模型中髓内细胞蛋白sigirr的表达水平的变化。方法建立SD大鼠胫骨癌痛模型,随机分为空白组(10只)和骨癌痛模型组(10只)。通过大鼠痛行为学测试、影像学、组织学方法对大鼠胫骨癌痛的模型进行验证。运用RT-PCR和Western blot检测髓内蛋白细胞LTR4和sigirr表达变化。结果 Walker256大鼠乳腺癌细胞制备大鼠胫骨癌痛的模型骨癌造模成功。模型组的体质量不增或者降低(P0.05)。RT-PCR检测的TLR4结果显示,骨癌痛模型组比空白组表达明显增加。Western blot检测骨癌痛模型组比空白组髓内蛋白细胞sigirr明显下降。结论骨癌痛大鼠髓内蛋白细胞sigirr表达的降低可能与骨癌痛的发生机制相关。

关键词：骨癌痛 sigirr TLR4 固有免疫

sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

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Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

作者：童子文安徽医科大学

学位级别：硕士

目的慢性肾病可以有多种因素造成,例如炎症反应、氧化应激等。CKD会并发肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）。IL-1β是一种常见的促炎症、促进纤维化发生的细胞因子,IL-1β通过结合IL-1受体IL-1R,依赖My D88进而激活NF-κ... 详细信息

目的慢性肾病可以有多种因素造成,例如炎症反应、氧化应激等。CKD会并发肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）。IL-1β是一种常见的促炎症、促进纤维化发生的细胞因子,IL-1β通过结合IL-1受体IL-1R,依赖My D88进而激活NF-κB信号通路,增加转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）。TGF-β1是肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化（epithelial-myofibroblast transition,EMT）的重要诱导分子,促进肾间质纤维化的发生和发展肾小管间质纤维化。sigirr作为IL-1β的负性调控分子,能与IL-1R和其他信号分子如My D88相互作用,从而抑制IL-β/IL-1R介导NF-κB信号通路的活化,在抑制肾内炎症发生有着重要作用。本文主要研究sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病（CKD）并发肾间质纤维化（RIF）中的作用和机制。方法1.动物模型的研究:（1）为了验证CKD并发RIF中是否与sigirr/NF-κB反馈调控机制,且该机制是否与IL-1β诱导的EMT发生有关,我们利用0.2%腺嘌呤饲料和正常饲料喂养分别喂养sigirr小鼠和sigirr小鼠12周以构建小鼠慢性肾损及并发RIF模型;生化分析的方法检测各组小鼠肾功能变化;利用H&E染色分析肾脏组织病理变化、通过Masson染色观察肾脏纤维化程度。（2）免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）和WB检测肾组织中IL-1β、NF-κB（p65）及其活化的NF-κB（p-p65）的水平变化以及与EMT相关的标记分子表达情况。2.细胞水平的研究（1）为了研究sigirr对IL-1β活化的NF-κB是否具有负调控作用,以小鼠的肾小管上皮细胞（mice renal tubular epithelial cells,m RTEC）作为研究的细胞模型。分别利用sigirr小鼠原代培养sigirr的m RTEC细胞株(m RTEC/sigirr)以及sigirr小鼠原代培养sigirr的m RTEC细胞株(m RTEC/sigirr),用重组人IL-1β（10 ng/ml）处理细胞,通过Western blot（WB）检测NF-κB（p65）及其活化的NF-κB（p-p65）的变化;（2）为了研究sigirr在IL-1β诱导的EMT发生中的作用,利用IL-1β处理m RTEC/sigirr及m RTEC/sigirr细胞,利用WB检测与EMT发生有关的标记分子,如:E-钙黏蛋白（E-cadherin）,波形蛋白（Vimentin）等。结果1.慢性肾病并发肾纤维化动物模型进一步证实,sigirr的缺失有利于NF-κB的活化并促进慢性肾病小鼠并发肾间质的发生（1）肾功能检测结果显示:与正常饲料喂养组WT小鼠和sigirr小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和sigirr小鼠血清尿素氮和肌酐水平升高。H&E染色显示对照组的小鼠肾组织形态及结构正常,在高嘌呤喂养组小鼠肾脏中观察到肾小管扩张、上皮细胞坏死和大量炎性细胞浸润、基底膜增厚且出现肾小球硬化等形式的肾损伤,而且sigirr小鼠肾脏组织中,炎性细胞浸润、小球充血等病理变化较对照组更明显。Masson染色结果显示:高腺嘌呤饲料喂养组出现蓝色沉积;与对照组肾脏组织比较,高腺嘌呤喂养组小鼠肾脏中胶原沉积显著增加,且sigirr小鼠肾组织的胶原沉积较sigirr小鼠更严重。（2）IHC和WB结果显示与正常饲料喂养组WT小鼠和sigirr小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和sigirr小鼠的IL-1β及下游Myd88和p-p65表达水平增加,且在sigirr小鼠中,IL-1β、Myd88和p-P65的增加比sigirr小鼠更显著。高嘌呤喂养组WT小鼠和sigirr小鼠的E-cadherin水平降低,TGF-β1以及Vimentin水平增加,且在sigirr小鼠中,E-cadherin的减少和TGF-β1、Vimentin的增加比sigirr小鼠更为明显。***通过反馈调控IL-1β诱导的m RTEC细胞中NF-κB的活化参与EMT发生。（1）在IL-1β处理细胞之后,m RTEC/sigirr细胞内p-P65水平在15 min时出现短暂的高峰,随后开始减少,24h时下降到初始水平。（2）较m RTEC/sigirr细胞而言,WB显示m RTEC/sigirr细胞p-p65水平增加更为显著。（3）WB结果显示,m RTEC/sigirr细胞在IL-lβ处理后,上皮细胞标记分子的E-cadherin明显降低,而间质标志物Vimentin明显增加,且在m RTEC/sigirr细胞中,E-cadherin的减少和Vi

关键词： sigirr 慢性肾病肾间质纤维化 IL-1β NF-κB

sigirr和IL-1F5对肠上皮细胞TLR/IL-1信号传导通路的作用机制

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SIGIRR和IL-1F5对肠上皮细胞TLR/IL-1信号传导通路的作用机制

作者：严红南昌大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:sigirr是新近发现的TLR/IL-1R超家族成员之一,能够负性调控TLR/IL-1信号传导通路,并主要在调控胃肠道系统的炎症反应中起重要作用。IL-1F5是一新的IL-1家族成员,有研究发现通过其与sigirr相互作用可抑制LPS诱导的炎症反... 详细信息

研究背景和目的:sigirr是新近发现的TLR/IL-1R超家族成员之一,能够负性调控TLR/IL-1信号传导通路,并主要在调控胃肠道系统的炎症反应中起重要作用。IL-1F5是一新的IL-1家族成员,有研究发现通过其与sigirr相互作用可抑制LPS诱导的炎症反应。两者都是TLR/IL-1信号传导通路的负性调节因子,有望成为IBD治疗的新靶点。为此,通过本文研究了TLR/IL-1信号传导通路及其抑制因子sigirr和IL-1F5在LPS作用的肠上皮细胞中的变化,以及外源性sigirr和IL-1F5对上述细胞内TLR/IL-1信号传导通路的影响,并阐明其负性调节机制,为其用于IBD的治疗的体内研究提供实验依据。方法:1.实验分组具体如下:①对照组1:T84细胞;②对照组2:转染了空白对照质粒的T84细胞;③对照组3:转染了sigirr基因的T84细胞;④实验组1:T84细胞+1μg/ml LPS;⑤实验组2:转染了空白对照质粒的T84细胞+1μg/ml LPS;⑥实验组3:转染了sigirr基因的T84细胞+1μg/ml LPS;以上各组均包含5ng/ml IL-1F5预处理和未处理两部分。2.培养肠上皮细胞株T84至对数生长期,分别予以IL-1F5预处理2小时和采用脂质体转染技术将pUNO-hsigirr转入T84细胞后,观察LPS刺激12小时对各指标的影响。3.用RT-PCR方法检测各组细胞sigirr、TLR2、TLR4、MyD88 mRNA的表达。4.用MTT法检测IL-1F5和LPS作用细胞前后细胞增殖情况。结果:1.各组细胞sigirr mRNA的表达:①转染sigirr使细胞中sigirr mRNA的表达显著升高(Psigirr mRNA的表达降低(Psigirr mRNA的表达无影响(P>0.05)。2.各组细胞TLR2 mRNA的表达:①转染sigirr对各组T84细胞内TLR2 mRNA的表达均无影响(P>0.05);②LPS刺激对各组细胞中TLR2 mRNA的表达无影响(P>0.05);③IL-1F5预处理对各组细胞中TLR2 mRNA的表达无影响(P>0.05)。3.各组细胞TLR4 mRNA的表达:①转染sigirr对各组T84细胞内TLR4 mRNA的表达均无影响(P>0.05);②LPS刺激后,细胞中TLR4 mRNA的表达显著升高(P0.05);③LPS刺激后,单独IL-1F5预处理组细胞内TLR4 mRNA表达低于单独sigirr转染组(Psigirr和IL-1F5共同作用组与单独IL-1F5预处理组无差别(P>0.05)。4.各组细胞MyD88 mRNA表达:①无论IL-1F5预处理与否,LPS刺激后,转染sigirr可使MyD88 mRNA的表达显著降低(Psigirr对MyD88 mRNA表达无影响(P>0.05);②LPS刺激下,细胞中MyD88 mRNA的表达升高(P0.05);③LPS刺激后,sigirr和IL-1F5共同作用组MyD88 mRNA表达低于单独sigirr转染组(Psigirr转染组和单独IL-1F5预处理组之间无差别(P>0.05)。***-1F5和LPS对T84细胞活力的影响:所有处理组对T84细胞的生长抑制率显著高于对照组(Psigirr的表达,同时上调TLR4和其信号通路的下游分子MyD88的表达。2.给予外源性sigirr基因可阻断LPS对TLR/IL-1信号通路的激活,下调MyD88的表达,这可能是其对TLR/IL-1信号通路的负性调控机制之一。3.给予外源性IL-1F5可阻断LPS对TLR/IL-1信号通路的激活,下调TLR4和MyD88的表达,这可能是其对TLR/IL-1信号通路的负性调控机制之一。

关键词： sigirr IL-1F5 TLR/IL-1信号通路 IBD

稳定敲低sigirr的人肾小管上皮细胞的构建及其初步功能的研究

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安徽医科大学学报 2015年第2期50卷 129-135页

作者：蒋克国王德光周海胜查晓军张桂霞金福泉季爽潘海峰叶冬青郝丽安徽医科大学第二附属医院肾脏内科合肥230601 安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室合肥230032 安徽医科大学药学院合肥230032 安徽医科大学第一临床学院合肥230032 安徽医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计系合肥230032

目的建立稳定敲低单免疫球蛋白白介素1相关受体(sigirr)基因的人肾小管上皮细胞株(HKC),并初步研究其功能。方法针对sigirr基因的有效靶点设计shRNA序列,与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体(GV248-GFP-Puro-sh sigirr)。将测序... 详细信息

目的建立稳定敲低单免疫球蛋白白介素1相关受体(sigirr)基因的人肾小管上皮细胞株(HKC),并初步研究其功能。方法针对sigirr基因的有效靶点设计shRNA序列,与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体(GV248-GFP-Puro-sh sigirr)。将测序验证正确的重组体与包装质粒(p MDL、pRev、p VSVG)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒并感染HKC细胞。实时荧光定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分析检测HKC细胞中sigirr干涉效率。应用白细胞介素-1β(IL-1β)刺激成功敲低sigirr的HKC细胞及对照细胞,Western blot法检测其下游核转录因子NF-κB(p65)的磷酸化水平,qRT-PCR分析单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白(RANTES)mRNA水平。结果成功构建重组慢病毒载体GV248-GFP-Puro-sh sigirr。qRT-PCR和Western blot法均证实在HKC细胞中成功敲低sigirr的表达。此外,IL-1β刺激后,与对照细胞相比,敲低sigirr的HKC细胞(HKC/sh sigirr)的p65磷酸化水平上调,MCP-1和RANTES mRNA表达水平升高。结论 HKC的炎症反应中,sigirr蛋白对Toll样受体/白介素1受体(TLR/IL-1R)通路起"刹车"作用。该研究为狼疮性肾炎的治疗提供了新的潜在的靶点。

关键词：狼疮性肾炎人肾小管上皮细胞 sigirr 慢病毒载体 NF-κB 趋化因子