Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

作     者：童子文 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周海胜

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：SIGIRR 慢性肾病 肾间质纤维化 IL-1β NF-κB 

摘      要：目的慢性肾病可以有多种因素造成,例如炎症反应、氧化应激等。CKD会并发肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）。IL-1β是一种常见的促炎症、促进纤维化发生的细胞因子,IL-1β通过结合IL-1受体IL-1R,依赖My D88进而激活NF-κB信号通路,增加转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）。TGF-β1是肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化（epithelial-myofibroblast transition,EMT）的重要诱导分子,促进肾间质纤维化的发生和发展肾小管间质纤维化。SIGIRR作为IL-1β的负性调控分子,能与IL-1R和其他信号分子如My D88相互作用,从而抑制IL-β/IL-1R介导NF-κB信号通路的活化,在抑制肾内炎症发生有着重要作用。本文主要研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病（CKD）并发肾间质纤维化（RIF）中的作用和机制。方法1.动物模型的研究:（1）为了验证CKD并发RIF中是否与SIGIRR/NF-κB反馈调控机制,且该机制是否与IL-1β诱导的EMT发生有关,我们利用0.2%腺嘌呤饲料和正常饲料喂养分别喂养Sigirr小鼠和Sigirr小鼠12周以构建小鼠慢性肾损及并发RIF模型;生化分析的方法检测各组小鼠肾功能变化;利用H&E染色分析肾脏组织病理变化、通过Masson染色观察肾脏纤维化程度。（2）免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）和WB检测肾组织中IL-1β、NF-κB（p65）及其活化的NF-κB（p-p65）的水平变化以及与EMT相关的标记分子表达情况。2.细胞水平的研究（1）为了研究SIGIRR对IL-1β活化的NF-κB是否具有负调控作用,以小鼠的肾小管上皮细胞（mice renal tubular epithelial cells,m RTEC）作为研究的细胞模型。分别利用Sigirr小鼠原代培养Sigirr的m RTEC细胞株(m RTEC/Sigirr)以及Sigirr小鼠原代培养Sigirr的m RTEC细胞株(m RTEC/Sigirr),用重组人IL-1β（10 ng/ml）处理细胞,通过Western blot（WB）检测NF-κB（p65）及其活化的NF-κB（p-p65）的变化;（2）为了研究SIGIRR在IL-1β诱导的EMT发生中的作用,利用IL-1β处理m RTEC/Sigirr及m RTEC/Sigirr细胞,利用WB检测与EMT发生有关的标记分子,如:E-钙黏蛋白（E-cadherin）,波形蛋白（Vimentin）等。结果1.慢性肾病并发肾纤维化动物模型进一步证实,Sigirr的缺失有利于NF-κB的活化并促进慢性肾病小鼠并发肾间质的发生（1）肾功能检测结果显示:与正常饲料喂养组WT小鼠和Sigirr小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr小鼠血清尿素氮和肌酐水平升高。H&E染色显示对照组的小鼠肾组织形态及结构正常,在高嘌呤喂养组小鼠肾脏中观察到肾小管扩张、上皮细胞坏死和大量炎性细胞浸润、基底膜增厚且出现肾小球硬化等形式的肾损伤,而且Sigirr小鼠肾脏组织中,炎性细胞浸润、小球充血等病理变化较对照组更明显。Masson染色结果显示:高腺嘌呤饲料喂养组出现蓝色沉积;与对照组肾脏组织比较,高腺嘌呤喂养组小鼠肾脏中胶原沉积显著增加,且Sigirr小鼠肾组织的胶原沉积较Sigirr小鼠更严重。（2）IHC和WB结果显示与正常饲料喂养组WT小鼠和Sigirr小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr小鼠的IL-1β及下游Myd88和p-p65表达水平增加,且在Sigirr小鼠中,IL-1β、Myd88和p-P65的增加比Sigirr小鼠更显著。高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr小鼠的E-cadherin水平降低,TGF-β1以及Vimentin水平增加,且在Sigirr小鼠中,E-cadherin的减少和TGF-β1、Vimentin的增加比Sigirr小鼠更为明显。***通过反馈调控IL-1β诱导的m RTEC细胞中NF-κB的活化参与EMT发生。（1）在IL-1β处理细胞之后,m RTEC/Sigirr细胞内p-P65水平在15 min时出现短暂的高峰,随后开始减少,24h时下降到初始水平。（2）较m RTEC/Sigirr细胞而言,WB显示m RTEC/Sigirr细胞p-p65水平增加更为显著。（3）WB结果显示,m RTEC/Sigirr细胞在IL-lβ处理后,上皮细胞标记分子的E-cadherin明显降低,而间质标志物Vimentin明显增加,且在m RTEC/Sigirr细胞中,E-cadherin的减少和Vi