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sd序列矩阵表示与保守性

内蒙古大学学报（自然科学版） 1999年第3期30卷 329-334页

作者：陈颖丽李前忠内蒙古大学物理学系

提出用矩阵形式表示一组核酸序列的方法．以大肠杆菌ＳＤ序列（在起始密码子ＡＴＧ前－１～－２５位点的２５个碱基范围内）为例给出了表示各位点单碱基、相邻双碱基、相邻三碱基出现的矩阵形式，并计算了体现序列的保守性、关联性的Ｍ... 详细信息

提出用矩阵形式表示一组核酸序列的方法．以大肠杆菌ＳＤ序列（在起始密码子ＡＴＧ前－１～－２５位点的２５个碱基范围内）为例给出了表示各位点单碱基、相邻双碱基、相邻三碱基出现的矩阵形式，并计算了体现序列的保守性、关联性的Ｍ（ｌ）值，发现大肠杆菌ＳＤ序列保守性，相邻双碱基。

关键词：矩阵表示保守性基因表达水平 DNA sd序列

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人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

中国医学科学院学报 1998年第4期20卷 279-284页

作者：毛华赵峻张劲秋狄旭陈卫东陈松森梁植权中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

目的经过改造重组人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF),提高其表达量。方法应用人工合成寡核苷酸引物及PCR技术,改变人干细胞因子hSCF cDNA起始密码子ATG与sd序列之间的距离及在翻译起始区(即N端氨基酸)部分采用大肠杆菌... 详细信息

目的经过改造重组人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF),提高其表达量。方法应用人工合成寡核苷酸引物及PCR技术,改变人干细胞因子hSCF cDNA起始密码子ATG与sd序列之间的距离及在翻译起始区(即N端氨基酸)部分采用大肠杆菌(***)喜用型密码子的策略,使重组表达质粒pBV220-hSCF在***中获得高效稳定表达。结果 DNA序列测定证明基因的阅读框架完全正确。重组人干细胞因子的表达量从改造前占***总蛋白的12%提高到40%左右。纯化的重组hSCF N端17个氨基酸测序结果表明,除第一个氨基酸为甲硫氨酸外,其余与天然hSCF序列完全一致。纯化的重组hSCF经Western blot证明,与标准hSCF一致。结论提示hSCF cDNA的5′侧翼区结构对其基因表达有显著的影响。

关键词：重组高效稳定表达 sd序列干细胞因子

基于SHAPE-seq技术解析大肠杆菌典型5′mRNA结构特征及其对基因表达的影响

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微生物学报 2024年第11期64卷 4440-4454页

作者：张金鹏任家卫梅子轮张晓梅徐国强李会史劲松许正宏张晓娟江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122 四川大学轻工科学与工程学院四川成都610065

【目的】在原核生物基因表达过程中,由于转录本mRNA半衰期较短,其抗降解能力和招募核糖体启动翻译反应的能力对基因表达的影响显著。然而mRNA在其5′端存在多个功能区域,可以影响其半衰期的长短进而影响目的基因的表达,其中主要包括:Shi... 详细信息

【目的】在原核生物基因表达过程中,由于转录本mRNA半衰期较短,其抗降解能力和招募核糖体启动翻译反应的能力对基因表达的影响显著。然而mRNA在其5′端存在多个功能区域,可以影响其半衰期的长短进而影响目的基因的表达,其中主要包括:Shine-Dalgarno(sd)序列以及其上下游的核糖体“等候”位点(translational standby site, TSS)、N端部分编码序列(N-terminal coding sequence, NCS)。各区域由于其自身和跨区域的结构差异会影响基因表达,因此解析各功能区域的构效关系至关重要。【方法】采用引物延伸测序(SHAPE-seq)技术,以大肠杆菌为宿主解析了7种结构不同的5′mRNA胞内的结构特点,采集了其调控下mRNA丰度以及蛋白表达量。【结果】发现非结构化的NCS调控下mRNA丰度和蛋白量分别提高了10倍、19倍;形成二级结构茎长为10nt的TSS有利于提高mRNA丰度;sd序列被包裹形成二级结构时会影响其介导的翻译起始效率(蛋白表达下降10%);上述较优的TSS和NCS的组合调控下,mRNA丰度和蛋白量显著提高(11倍、60倍)。【结论】本研究解析了5′mRNA各区域有利于原核生物基因表达的结构特征,初步建立了各功能区域的构效关系,为工业微生物目标基因表达提供了新型调控元件。

关键词：核糖体等候位点 N端编码序列 sd序列引物延伸测序构效关系

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5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

生物工程学报 1994年第1期10卷 7-12页

作者：叶棋浓陈添弥军事医学科学院生物工程研究所北京100850

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重... 详细信息

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联sd序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个sd序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的sd序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身sd序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的sd序列好;在只含单个LT-B基因sd序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。

关键词：热敏感肠毒素 5'端非翻译区 sd序列

高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化

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微生物学通报 2016年第10期43卷 2121-2128页

作者：张晓欢崔文璟周哲敏江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G... 详细信息

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G上游的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno sequence,sd)替换成翻译起始强度更高的异源sd,同时优化各亚基之间间隔序列的长度,并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过***重组表达系统过表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase进行纯化,并通过凝胶过滤层析确定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件,并建立底物恒速流加的细胞催化工艺,模拟了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase在***中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性为85.5±4.3 U/mg,纯酶比活为234.0±11.7 U/mg,H-NHase相对分子质量为504.5±9.8 k D。细胞催化最适p H为7.5,最适温度为25°C,底物浓度为400 mmol/L。在此条件下,重组菌细胞酶活为256.0±10.4 U/m L,流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase大肠杆菌细胞生长迅速,发酵周期短,应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率,具有潜在的工业价值。

关键词：高分子量型腈水合酶密码子偏好性优化 sd序列间隔序列重组表达细胞催化

基于rhaSR嵌合操纵子的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

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微生物学通报 2007年第6期34卷 1129-1133页

作者：关梅贾坤志李芳贺根和喻富根华子春南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室南京210093

通过PCR等重组DNA技术,构建了含rhaSR启动子表达调控元件、RhaR基因、报告基因gst(谷胱甘肽-S-转移酶)的两个嵌合操纵子,并插入大肠杆菌表达载体pALEX中构成pALEX-PR1和pALEX-PR2。其中pALEX-PR2的RhaR基因上游为原有的sd序列,而pALEX-... 详细信息

通过PCR等重组DNA技术,构建了含rhaSR启动子表达调控元件、RhaR基因、报告基因gst(谷胱甘肽-S-转移酶)的两个嵌合操纵子,并插入大肠杆菌表达载体pALEX中构成pALEX-PR1和pALEX-PR2。其中pALEX-PR2的RhaR基因上游为原有的sd序列,而pALEX-PR1的RhaR基因上游则插入了增强的sd序列。把这两个重组表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中,报告基因gst能够在L-鼠李糖诱导下表达,其表达量是非诱导条件下的4～5倍,且pALEX-PR1的表达量是pALEX-PR2的3.14倍。以上结果表明,gst的表达既受L-鼠李糖诱导,同时又受RhaR的正调控。sdS-PAGE结果显示,GST占大肠杆菌培养物总可溶蛋白的5.41%(W/W),平均1L培养物可获得3.0mg纯化的GST。酶活性分析表明,所构建的嵌合操纵子表达的GST保持了正确的构型且具有很高的活性。

关键词： rhaSR 嵌合操纵子 sd序列基因表达

L─山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

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微生物学通报 1998年第3期25卷 139-143页

作者：郭新友尹光琳中国科学院上海生物工程研究中心上海200233

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列，合成了两个引物序列，以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应，克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因，经酶切验证与预期结果相同，序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法... 详细信息

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列，合成了两个引物序列，以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应，克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因，经酶切验证与预期结果相同，序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法在此基因的两端加上了***和HindⅢ两个酶切位点，经***和HindⅢ酶切后去掉了两端的多余序列后，将此片段连接到pKKH上，经诱导无蛋白表达，采用RcaI酶切启动子端，对载体pKKH则采用Mcol酶切，使表达载体的sd序列与起始密码子ATG之间的距离减少了一个碱基，终止子端仍采用HindⅢ酶切，连接后进行转化，得到的阳性克隆经诱导后有明显的蛋白表达条带，酶活力也比对照明显增高。此工作为构建可直接利用L－山梨糖发酵产生维生素C前体2－酮基－L－古龙酸的基因工程菌打下了基础。

关键词： PCR 表达载体 sd序列克隆表达

改变部分TIR对EPO模拟肽8串联体表达的影响

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第四军医大学学报 2001年第3期22卷 224-226页

作者：韩苇颜真王俊楼赵永同石继红张英起第四军医大学生物技术中心陕西西安710033

目的　通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法　设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco R... 详细信息

目的　通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法　设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco RI和 X ba I位点 ,经 DNA测序确定正确重组质粒 ,再将 EPO模拟肽基因 8串联体 (含改建的翻译起始区域 )克隆到 p BV2 2 0载体的 Eco RI和 Bam HI位点 ,诱导表达 .结果　 DNA测序证明 ,人工合成的 DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因 8串联体的翻译起始区域 .该串联体基因插入 p BV2 2 0载体后 ,经 42℃诱导 ,在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为 2 2× 10 3(Mr)的新蛋白带 ,与 EPO模拟肽基因 8串联体的理论计算分子量相符合 .经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的 15 % .结论　通过改变部分翻译起始区域起动了 EPO模拟肽基因 8串联体的翻译 ,使原来不表达的 EPO模拟肽基因

关键词：翻译起始区域 sd序列 EOP模拟肽基因串联体

耐高温α-淀粉酶定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达

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耐高温α-淀粉酶定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达

作者：李婷璐天津大学

学位级别：硕士

淀粉酶作为目前工业上最重要的酶制剂之一,约占整个工业酶生产的50%。其中,耐高温α-淀粉酶由于具备高温条件下水解淀粉的能力,使其在食品、发酵、纺织、造纸等工业都具有极高的用途。目前,工业用的耐高温α-淀粉酶主要为地衣芽孢杆菌α... 详细信息

淀粉酶作为目前工业上最重要的酶制剂之一,约占整个工业酶生产的50%。其中,耐高温α-淀粉酶由于具备高温条件下水解淀粉的能力,使其在食品、发酵、纺织、造纸等工业都具有极高的用途。目前,工业用的耐高温α-淀粉酶主要为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)。然而,使用野生型地衣芽孢杆菌做为生产BLA的发酵宿主具有产酶量小,杂蛋白多等缺陷,因此需要开发新的工程菌来作为BLA表达宿主以满足其大量的工业需求。另外,在某些更加极端苛刻的工业环境下,野生型BLA已经难以满足其要求。开发耐受更高温度,适应更低pH,且不依赖Ca2+的新型耐高温α-淀粉酶已成为淀粉酶研究主要方向之一。本研究首先通过查阅相关文献以及专利,确定了两个BLA氨基酸突变位点,即将野生型BLA成熟肽第190位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸,第264位的谷氨酰胺突变为丝氨酸,从而使其具有更高热稳定性以及更低Ca2+依赖性。随后将突变后的氨基酸序列针对枯草芽孢杆菌表达宿主进行了密码子优化,合成了突变型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyLM。在枯草芽孢杆菌168菌株中实现了amyLM的成功表达,90℃下测得耐高温淀粉酶酶活为46U/ml。其次,本研究为进一步提高amyLM在枯草芽孢杆菌中发酵液中的酶活进行了优化。改用缺少8个蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB800n工程菌作为表达宿主,并且对强启动子P43介导amyLM的表达进行分子层面的深入研究。通过改变amyLM基因与P43启动子sd序列之间的距离,研究了不同距离对于amyLM表达量的影响,优化了P43的使用方法。结果表明,当使用距离P43启动子的sd序列为9bp的起始密码子ATG作为amyLM的起始密码子时,发酵液中BLA酶活最高,达到422U/ml,是未优化前的9.17倍。本研究中对于P43介导amyLM的表达所进行的分子层面的优化为后续使用P43介导其他外源蛋白的表达提供了思路。最后,本研究还使用麦芽糖诱导型启动子Pglv介导amyLM以及野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyL在WB800n中的表达。其中,突变型amyLM在WB800n发酵液酶活分别为268U/ml,是野生型amyL酶活144U/ml的1.86倍。为后期进一步对比研究amyLM与amyL的酶学特性做铺垫。

关键词：耐高温α-淀粉酶枯草芽孢杆菌表达系统 P43启动子 sd序列 Pglv启动子