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血管内皮细胞中RhoC的表达对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和侵袭的影响

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肿瘤防治研究 2022年第4期49卷 299-303页

作者：孙淼淼刘凯王瞳邱森赵志华陈奎生郑州大学第一附属医院病理科河南省肿瘤病理重点实验室郑州450052 郑州大学附属郑州中心医院病理科郑州450007 商丘工学院医学院商丘476000 郑州人民医院病理科郑州450000

目的探讨RhoC在血管内皮细胞中表达对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、侵袭能力的影响及可能机制。方法构建RhoC shRNA慢病毒载体转染骨髓瘤血管内皮细胞(MVECs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别采用CCK-8试剂盒、流式细胞仪、Transwell实验检... 详细信息

目的探讨RhoC在血管内皮细胞中表达对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、侵袭能力的影响及可能机制。方法构建RhoC shRNA慢病毒载体转染骨髓瘤血管内皮细胞(MVECs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别采用CCK-8试剂盒、流式细胞仪、Transwell实验检测条件培养基对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、细胞周期和侵袭能力的影响;Western blot法检测CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9等蛋白表达。结果下调MVECs和HUVECs中RhoC表达,RhoC shRNA组骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和侵袭能力均较阴性对照组降低,细胞周期阻滞在G_(0)/G_(1)期(PRhoC shRNA组CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9等蛋白表达均较阴性对照组降低(PRhoC在MVECs中表达,对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和侵袭能力具有调节作用;其机制可能与CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9等参与有关。

关键词： RhoC 骨髓瘤血管内皮细胞细胞增殖侵袭

健脾消癌方通过miRNA-10b/HOXD10/RhoC信号调控人结肠癌细胞的迁移

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健脾消癌方通过miRNA-10b/HOXD10/RhoC信号调控人结肠癌细胞的迁移

作者：李颖英湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究健脾消癌方对人结肠癌细胞miRNA-10b/HOXD10/RhoC信号通路的调控,探讨健脾消癌方抑制CRC迁移的作用机制。方法:先用实时荧光定量PCR检测miR-10b和HOXD10 mRNA在NCM460、SW480、SW620、HCT116四种不同结肠癌细胞系中的表达情况... 详细信息

目的:研究健脾消癌方对人结肠癌细胞miRNA-10b/HOXD10/RhoC信号通路的调控,探讨健脾消癌方抑制CRC迁移的作用机制。方法:先用实时荧光定量PCR检测miR-10b和HOXD10 mRNA在NCM460、SW480、SW620、HCT116四种不同结肠癌细胞系中的表达情况。从以上四种细胞中选出miRNA-10b表达量最高的细胞。然后分别用10%、15%、20%健脾消癌方含药血清和1 5%的空白血清培养筛选出的细胞,培养24小时后实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-10b及HOXD10 mRNA的表达情况,免疫印迹检测法检测各组细胞HOXD10、RhoC蛋白表达情况。结果:根据实时荧光定量PCR检测miR-10b和HOXD10 mRNA在NCM460、SW480、SW620、HCT116四种不同结肠癌细胞系中的表达结果知,与NCM460细胞株相比,细胞株SW480、SW620、HCT116的HOXD10 mRNA的相对表达水平降低（P＜0.01）,miR-10b的相对表达水平有所升高（SW480P＜0.05,SW620、HCT116 P＜0.01）,与细胞株SW480、SW620相比,HCT116细胞株HOXD10 mRNA的相对表达水平有所下降（SW480P＜0.01,SW620 P＜0.05）,miR-10b相对表达水平升高（SW480 P＜0.01,SW620 P＜0.05）。HCT116细胞miR-10b表达水平在四种细胞中最高,所以选择HCT116细胞作为本次实验的研究对象来进行下一步的研究。分别用1 0%、15%、20%健脾消癌方含药血清和1 5%的空白血清培养HCT116细胞,培养24小时后实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-10b及HOXD10 mRNA的表达情况,结果提示与空白组比较,健脾消癌方1 0%浓度组miR-10b的相对表达量降低,HOXD10 mRNA的相对表达量有所升高,但差异都没有统计学意义。健脾消癌方1 5%、20%浓度组miR-10b的相对表达降低（P＜0.01）;HOXD10 mRNA相对表达升高（15%浓度组P＜0.05,20%浓度组P＜0.01）。和空白组相比,健脾消癌方10%、15%浓度组HOXD10蛋白相对表达量有所升高,RhoC蛋白相对表达量也有降低,但差异并没有统计学意义,健脾消癌方20%浓度组HOXD10蛋白相对表达量升高（P＜0.05）,RhoC蛋白相对表达量明显降低（P＜0.01）。结论:1.四种结肠癌细胞miR-10b、HOXD10 mRNA表达量不同,且两者呈负相关。2.健脾消癌方抑制结肠癌的迁移作用可能是通过下调miR-10b、RhoC,上调HOXD10实现的。

关键词：健脾消癌方结肠癌 miR-10b HOXD10 RhoC

栓菌酸通过RhoC/ROCK1通路对肝癌HepG2.2.15细胞迁移侵袭的影响

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中国中药杂志 2024年第1期49卷 185-196页

作者：万雨莲汪鋆植袁园叶汪阳李华丽张晓兰张宏岐李莉娥三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室湖北宜昌443002 广西医科大学基础医学院广西南宁530021 宜昌人福药业有限责任公司湖北宜昌443000

以Ras同源基因家族成员C(Ras homolog gene family member C, RhoC)为靶点探讨栓菌酸(trametenolic acid, TA)对人肝癌HepG2.2.15细胞迁移侵袭的影响及机制,为栓菌酸的利用提供依据。采用MTT法检测TA对HepG2.2.15细胞增殖的影响;划痕实... 详细信息

以Ras同源基因家族成员C(Ras homolog gene family member C, RhoC)为靶点探讨栓菌酸(trametenolic acid, TA)对人肝癌HepG2.2.15细胞迁移侵袭的影响及机制,为栓菌酸的利用提供依据。采用MTT法检测TA对HepG2.2.15细胞增殖的影响;划痕实验、Transwell实验检测TA对细胞迁移、侵袭的影响;pull down实验检测TA对Ras相似物GTP酶(Ras homologue GTPases, Rho GTPases)活性的影响;Western blot实验检测TA对RhoC从胞质到胞膜转运及对RhoC/Rho相关激酶1(Rho-associated kinase 1, ROCK1)/肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)/基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotease 2, MMP2)/基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotease 9,MMP9)通路相关蛋白表达的影响;采用瞬时质粒转染过表达pcDNA3.1-RhoC,激光共聚焦检测细胞骨架中F-actin的变化,并检测细胞迁移侵袭及RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9通路相关蛋白表达的变化,以及RhoC GTP酶活性;建立BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,以索拉菲尼为阳性对照(Sora 20 mg·kg^(-1)),测量TA低、中、高剂量组(40、80、120 mg·kg^(-1))瘤体积和质量,瘤组织通过Western blot检测相关蛋白的表达。结果显示,TA呈浓度依赖性抑制HepG2.2.15细胞增殖,24、48 h的IC50分别为66.65、23.09μmol·L^(-1)。裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积均显著降低,索拉菲尼,TA低、中、高剂量组的抑瘤率分别为62.23%、26.48%、55.45%、62.36%。TA能显著降低HepG2.2.15细胞迁移侵袭数,且呈浓度依赖性抑制RhoC蛋白的表达及RhoC GTP酶活性,使膜组分RhoC显著下调,减少膜结合RhoC GTP酶的量。体内外实验证实,TA可显著抑制RhoC下游ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9蛋白表达。HepG2.2.15细胞转染pcDNA3.1-RhoC过表达RhoC后,TA能有效抑制过表达后RhoC、ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9蛋白的表达水平,及RhoC GTP酶的活性,与过表达前相对抑制水平相似。综上所述,TA可抑制人肝癌HepG2.2.15细胞迁移侵袭,其机制可能是通过靶向抑制RhoC GTP酶的活性,下调RhoC表达,从而抑制RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9信号通路。该研究为利用中药有效成分多靶点优势,开发以热休克蛋白90α(heat shock protein 90α,HSP90α)为靶点的自噬调节剂,达到阻滞肝癌细胞增殖,同时抑制肝癌细胞的侵袭和转移双重作用提供了新思路和方法。

关键词：栓菌酸肝癌 RhoC 迁移侵袭 HSP90α

大蒜素对PC-3细胞生物学行为及miR-146a-5p表达的影响

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中国老年学杂志 2023年第7期43卷 1673-1677页

作者：李勇孙建明曾向阳陈晓锋邹义华张威邓毕华聂丙飞郴州市第一人民医院泌尿外科湖南郴州423000

目的探讨大蒜素对PC-3细胞生物学行为及miR-146a-5p表达的影响。方法取PC-3细胞株分为A组(无药物干预的PC-3细胞株)、B组(A组+25μmol/L大蒜素溶液)、C组(A组+50μmol/L大蒜素溶液)及D组(A组+100μmol/L大蒜素溶液),采用噻唑蓝(MTT)检测... 详细信息

目的探讨大蒜素对PC-3细胞生物学行为及miR-146a-5p表达的影响。方法取PC-3细胞株分为A组(无药物干预的PC-3细胞株)、B组(A组+25μmol/L大蒜素溶液)、C组(A组+50μmol/L大蒜素溶液)及D组(A组+100μmol/L大蒜素溶液),采用噻唑蓝(MTT)检测PC-3存活率,Hoechst染色检测凋亡程度,Transwell小室检测侵袭数目,Western印迹检测ROCK1及RhoC蛋白,qRT-聚合酶链反应(PCR)检测时增加E组(D组+miR-146a-5p激动剂)检测5组ROCK1、RhoC及miR-146a-5p mRNA表达。结果A、B、C、D组细胞存活率、侵袭数目、ROCK1和RhoC蛋白及mRNA依次降低,凋亡率及miR-146a-5p mRNA依次增加,差异均有统计学意义(PRhoC表达相关。

关键词：人前列腺癌PC-3细胞株大蒜素 miR-146a-5p 增殖 ROCK1 RhoC

川续断皂苷Ⅵ对小鼠脓毒症的保护作用及其机制研究

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川续断皂苷Ⅵ对小鼠脓毒症的保护作用及其机制研究

作者：庞彩霞南方医科大学

学位级别：硕士

脓毒症(sepsis)是一类由病原体感染所致的全身性炎症反应综合征,常伴有多器官功能障碍。目前治疗脓毒症的主流方式仍为支持疗法和抗生素应用,但由于其复杂的发病机制,该病的死亡率和发病率一直都居高不下,已经成为重症监护病人死亡的主... 详细信息

脓毒症(sepsis)是一类由病原体感染所致的全身性炎症反应综合征,常伴有多器官功能障碍。目前治疗脓毒症的主流方式仍为支持疗法和抗生素应用,但由于其复杂的发病机制,该病的死亡率和发病率一直都居高不下,已经成为重症监护病人死亡的主要原因,也一直是临床医学领域关注的焦点。脓毒症一旦没有得到及时的干预,会从早期的高炎症状态演变成随后的低炎症状态,极易引发严重脓毒症休克甚至多器官功能障碍。川续断皂苷Ⅵ(AⅥ)是一种三萜皂苷类化合物,已被证明在神经炎、心肌炎、骨质疏松等炎症疾病上有明显的抗炎免疫作用。然而,AⅥ在脓毒症中的作用及潜在机制尚不清楚。本研究通过同时采用LPS诱导脓毒症和盲肠结扎穿刺术(CLP)诱导脓毒症的方法建立炎症小鼠模型,考察AⅥ在脓毒血症小鼠中的作用以及可能的作用机制。研究方法:1.体外实验,利用LPS刺激的骨髓单核巨噬细胞(BMMs)和THP-1来源巨噬细胞诱导细胞炎症模型,使用川续断皂苷Ⅵ对其进行药物干预,实验分组为空白对照组(Blank),LPS模型组(LPS),LPS+川续断皂苷Ⅵ组(AⅥ),LPS+乌司他丁阳性药物组(UTI)。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测AⅥ对LPS诱导炎症的保护作用。2.体内实验,通过采用CLP和LPS诱导脓毒症模型相结合的方法,探讨AⅥ对小鼠脓毒症的作用及作用机制。CLP诱导脓毒症模型动物分组包括:空白对照组(Blank)、CLP 模型组(CLP)、CLP+AⅥ低高剂量组(A10:10mg/kg/d、A20:20mg/kg/d)、CLP+乌司他丁阳性药物组(UTI:5×104U/kg)。LPS 诱导脓毒症模型动物分组包括:空白对照组(Blank)、LPS模型组(LPS)、LPS+AⅥ低高剂量组(A10:1 Omg/kg/d、A20:20mg/kg/d)、LPS+乌司他丁阳性药物组(UTI:5×104U/kg)。在造模前14天开始灌胃给药处理,每天一次。术后测定小鼠肛门温度和对小鼠进行行为学评分;检测小鼠腹腔灌洗液细菌含量;ELISA检测血浆中炎症因子水平;测定血浆中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)和乳酸脱氢酶(LD)含量;评价肺组织的干、湿重比;对小鼠的肝、脾、肺进行H&E染色。采用Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化检测脾和肺组织中信号通路的变化。研究结果:1.在体外,与LPS组相比,AⅥ和UTI预处理后能明显抑制炎症因子的表达。而AⅥ能通过调控Hippo信号通路和Rho家族抑制炎症的发生发展。2.体内实验中,AⅥ和UTI均可抑制CLP和LPS诱导脓毒症小鼠的炎症因子的表达,降低腹腔灌洗液中的细菌含量。此外,药物预处理后减轻了脓毒症引起的肝、脾、肺损伤,并减少了炎症反应。而且这些保护作用是对Hippo信号通路和Rho家族的抑制介导的。研究结论:1.AⅥ对脓毒血症小鼠具有保护作用,能抑制脓毒症小鼠的炎症反应,并减少小鼠腹腔灌洗液中细菌的含量。2.AⅥ的预防治疗能减轻脓毒症引起的器官损伤,并减少炎症反应。3.在脓毒症模型中,AⅥ能显著抑制Hippo信号通路以及Rho家族,保护小鼠免受侵害。

关键词：脓毒症炎症川续断皂苷Ⅵ Hippo 信号通路 RhoC

RhoC shRNA对骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖及骨髓瘤移植瘤血管生成的影响

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RhoC shRNA对骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖及骨髓瘤移植瘤血管生成的...

作者：王瞳郑州大学

学位级别：硕士

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是浆细胞恶性增殖性疾病,发病率在血液系统恶性肿瘤中位居第二位,近年来在我国发病率呈逐年上升趋势。MM发病机制复杂,研究发现血液系统肿瘤的生物学行为同实体肿瘤一样受到血管生成的影响,并且在M... 详细信息

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是浆细胞恶性增殖性疾病,发病率在血液系统恶性肿瘤中位居第二位,近年来在我国发病率呈逐年上升趋势。MM发病机制复杂,研究发现血液系统肿瘤的生物学行为同实体肿瘤一样受到血管生成的影响,并且在MM疾病发展过程中,病理性血管生成对MM起促进作用。骨髓瘤血管生成过程中内皮细胞处于核心位置,参与血管腔的改建,新生和稳定等全部过程,是骨髓瘤新生血管扩张的关键因素。研究发现,Rho（Ras homologous）家族成员RhoC,通过调节细胞骨架参与肿瘤血管的形成,对多发性骨髓瘤浸润转移发挥重要作用。前期研究中发现RhoC不仅在MM细胞表达,同样表达于骨髓瘤内皮细胞（multiple myeloma vein endothelial cells,MVECs）和正常人脐静脉内皮细胞（normal human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）中,推测下调 RhoC在MVECs中的表达会减少骨髓瘤血管生成,且RhoC可直接参与MM血管内皮细胞的形态或功能调节。关于下调MM细胞内RhoC表达体内对血管生成的影响,以及下调MVECs中RhoC表达对MM细胞是否存在影响还需进一步研究。本课题分为两部分展开研究。第一部分采用慢病毒包装RhoC shRNA转染MVECs和HUVECs,并收集转染后各组内皮细胞培养基条件培养PMI8226细胞;qRT-PCR 和 Western blot 检测各组 PMI8226 细胞 RhoC mRNA 和蛋白表达;CCK-8法、transwell侵袭实验、流式细胞技术分别检测各组RPMI8226细胞增殖、侵袭能力和细胞周期变化;Western blot 检测 PI3K、CDK、CyclinD1、MMP2 及 MMP9等蛋白表达。通过以上实验:观察下调MVECs中RhoC表达对PMI8226细胞的生物学行为是否产生影响,并探讨下调MVECs内RhoC表达影响骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、侵袭能力及细胞周期变化的可能机制。MM新生血管生成是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。前期研究揭示了RhoC在MVECs生理活动中发挥重要作用,但下调PMI8226细胞中RhoC的表达,体内对新生血管的影响尚不明确。因此在第二部分,构建MM移植瘤模型,记录MM移植瘤生长;免疫组化方法检测Ki-67在MM移植瘤中表达;计数MM移植瘤内微血管密度（microvascular density,MVD）;计数Matrigel内由VEGF诱导的MM移植瘤内新生血管数及血管长度。探讨下调PMI8226细胞内RhoC表达对PMI8226细胞增殖,MM移植瘤生长和MM移植瘤内血管新生的影响,以期为探索临床治疗MM的新方法提供理论依据。第一部分下调MVECs中RhoC表达对MM细胞生物学行为的影响1 材料和方法1.1 骨髓瘤血管内皮细胞的诱导和鉴定骨髓瘤细胞上清液作为条件培养基诱导HUVECs细胞获得MVECs。鉴定方法:①CCK-8检测细胞增殖;②transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移、侵袭能力;③qRT-PCR检测肿瘤血管内皮细胞特异标志物TEM1、TEM8的表达;④ELISA检测肿瘤内皮细胞内VEGFA的表达含量。通过上述方法检测诱导后内皮细胞是否具有肿瘤内皮细胞特性。1.2 RhoC shRNA转染MM血管内皮细胞对RPMI8226细胞生物学行为的影响（1）细胞的分组培养根据前期研究基础,选用慢病毒包装的RhoC shRNA-3、RhoC shRNA-NC质粒,转染HUVECs和MVECs,荧光显微镜下评价转染效果。分别培养转染后各组HUVECs和MVECs 48h后收取上清,作为条件培养基诱导RPMI8226细胞,RPMI8226细胞分组培养如下:MVEC-S培养组:转染RhoC shRNA后MVECs上清液作为条件培养基培养RPMI8226细胞;MVEC-NC培养组:转染RhoC shRNA-NC后MVECs上清液条件培养RPMI8226细胞;HUVEC-S培养组:转染RhoC shRNA后HUVECs上清液条件培养RPMI8226细胞;HUVEC-NC培养组:转染RhoC shRNA-NC后HUVECs上清液条件培养RPMI8226细胞。（2）观察下调MVECs中RhoC表达对MM细胞生物学行为的影响及可能机制采用 qRT-PCR 和 Werstern blot 检测各组 RPMI8226 细胞中的 RhoC mRNA和蛋白表达;采用流式细胞术、transwell侵袭实验分别检测各组RPMI8226细胞的细胞周期和侵袭能力;采用Werstern blot检测各组RPMI8226细胞中的PI3K、Akt、CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白含量。1.3 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析,所有数据资料均采

关键词：多发性骨髓瘤血管生成 RhoC 裸鼠移植瘤

RNA干扰沉默RhoC基因抗炎性乳腺癌侵袭的研究

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中华实验外科杂志 2017年第12期34卷 2102-2104页

作者：徐旭东张万义沈汉斌罗智勇吴亚群武汉市第五医院肿瘤综合科 430050 武汉市第五医院皮肤科 430050 华中科技大学同济医学院附属同济医院甲乳外科武汉430030

目的观察利用RNA干扰（RNAi）技术沉默炎性乳腺癌（IBC）细胞SUM149和SUM190 RhoC基因对肿瘤细胞侵袭的影响。方法人炎性乳腺癌细胞按均衡随机方法分为空白对照组、阴性脂质体组、RhoC-小干扰RNA（siRNA）转染组，人炎性乳腺癌细胞SUM14... 详细信息

目的观察利用RNA干扰（RNAi）技术沉默炎性乳腺癌（IBC）细胞SUM149和SUM190 RhoC基因对肿瘤细胞侵袭的影响。方法人炎性乳腺癌细胞按均衡随机方法分为空白对照组、阴性脂质体组、RhoC-小干扰RNA（siRNA）转染组，人炎性乳腺癌细胞SUM149和SUM190中转染RhoC-siRNA，利用显微镜分析转染效率。转染后48 h，应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测RhoC mRNA的表达水平，应用Western blot检测RhoC蛋白的表达水平。利用Transwell小室检测转染后肿瘤细胞的侵袭能力。结果应用RhoC-siRNA转染人炎性乳腺癌细胞SUM149和SUM190，转染效率可以达到80%。在SUM149细胞中，阴性脂质体组与RhoC-siRNA转染组RhoC蛋白的平均表达水平分别为0.897±0.376、0.375±0.164，差异有统计学意义（t＝6.274，P＝0.045）。在SUM190细胞中，阴性脂质体组与RhoC-siRNA转染组RhoC蛋白的平均表达水平分别为0.902±0.386、0.381±0.166，差异有统计学意义（t＝6.891，P＝0.028）。在侵袭实验中，SUM149细胞RhoC-siRNA转染组和阴性脂质体组穿膜细胞数分别为（85.6±12.7）、（340.5±43.4）个，差异有统计学意义（t＝12.275，P＝0.034）。SUM190细胞RhoC-siRNA转染组和阴性脂质体组穿膜细胞数分别为（92.8±15.6）、（345.9±47.7）个，差异有统计学意义（t＝11.769，P＝0.022）。结论应用RhoC-siRNA转染人炎性乳腺癌细胞SUM149和SUM190，可以有效抑制肿瘤细胞的侵袭。

关键词：炎性乳腺癌 RhoC RNA干扰基因沉默

RhoC shRNA体外对骨髓瘤血管内皮细胞功能的影响及可能机制

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RhoC shRNA体外对骨髓瘤血管内皮细胞功能的影响及可能机制

作者：刘凯郑州大学

学位级别：硕士

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）属于血液系统恶性肿瘤的一种,以淋巴B细胞恶性增殖为主,约占血液肿瘤的10%。血管生成不仅在实体肿瘤中起重要作用,在血液系统恶性肿瘤尤其骨髓瘤中也起到重要作用。血管生成过程十分复杂,包括血管... 详细信息

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）属于血液系统恶性肿瘤的一种,以淋巴B细胞恶性增殖为主,约占血液肿瘤的10%。血管生成不仅在实体肿瘤中起重要作用,在血液系统恶性肿瘤尤其骨髓瘤中也起到重要作用。血管生成过程十分复杂,包括血管内皮细胞的增殖、迁移、管腔的形成等过程。近年来研究发现,Rho（Ras homologous）家族中的成员之一RhoC,除了参与调节肿瘤细胞的骨架形成、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡、细胞转录、细胞转化及肿瘤细胞的浸润和转移外,还参与肿瘤血管的形成。肿瘤血管的生成受到肿瘤微环境、肿瘤细胞和各种生长因子等多种物质共同介导,过程十分复杂。单纯以骨髓瘤细胞为靶点进行抗肿瘤血管生成并不能取得令人满意的效果。研究发现,RhoC在多发性骨髓瘤细胞和血管内皮细胞中均有表达,而RhoC在肿瘤组织中的高表达往往与血管的形成有密切的关系,因而推测RhoC在血管内皮细胞中的表达参与了血管内皮细胞形态和功能的调节,进而起到了促进骨髓瘤组织中的血管生成的作用。通过构建RhoC shRNA质粒和慢病毒载体,在体外转染骨髓瘤血管内皮细胞（myeloma vascular endothelial cells MVECs）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）;采用Western blot和qRT-PCR进行检测细胞中RhoC表达情况;采用罗丹明标记的鬼笔环肽进行细胞骨架染色,并运用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架;扫描电子显微镜观察内皮细胞伪足形态和数量;采用划痕实验检测RhoC对血管内皮细胞迁移能力的影响;在Matrigel基质胶上观察RhoC对血管内皮细胞成环能力的影响;采用Cytodex 3微载体培养内皮细胞,将细胞微载体球接种在Matrigel基质胶上观察内皮细胞出芽数目;采用Western blot技术检测ROCK和MAPK蛋白表达情况。探讨RhoC与血管内皮细胞功能关系的研究,将为进一步阐明骨髓瘤血管生成机制和临床肿瘤血管生成的靶向治疗提供理论依据。材料和方法1骨髓瘤血管内皮细胞的分离和鉴定收集骨髓瘤患者组织标本,无菌条件下于冰上取病灶无坏死组织,使用抗CD14、抗CD45、抗CD64磁珠进行阴性筛选,去除样品中混杂的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞,然后进行细胞培养。采用免疫细胞化学方法检测CD31、CD34、vWF、CD105等血管内皮标志物鉴定该细胞。2培养骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞并检测Rho C表达使用Gibco胎牛血清和DMEM培养基培养血管内皮细胞,免疫细胞化学、Western blot和qRT-PCR技术检测血管内皮细胞中RhoC蛋白和RhoC mRNA表达情况。3转染骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞3.1 RhoC shRNA质粒构建及分组构建RhoC shRNA质粒,针对人源RhoC设计4条干扰序列S1:RhoC shRNA-1;S2:RhoC shRNA-2;S3:RhoC shRNA-3;S4:RhoC shRNA-4;以及1条无关序列NC:RhoC shRNA-NC;将5条RhoC shRNA质粒分别转染骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞中,通过荧光显微镜和Western blot技术筛选出最佳干扰序列。并使用最佳干扰序列（S组）和阴性对照组（NC）进行后续实验。3.2采用脂质体转染方法将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染待细胞生长至60%时,将上述各组质粒分别与脂质体进行充分混合,然后加入各组细胞中,12h后换成完全培养基。分别观察转染后24h、48h、72h细胞转染效率,并检测各组干扰效果。转染效率评定按照每200×视野下荧光细胞数目所占百分比计算,每组细胞随机选5个视野。3.3采用电穿孔转染方法将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染将培养的各组细胞消化混悬并转移至96孔板中,将电转液和上述质粒混合加入各孔中,调节电转仪参数并对培养的各组细胞进行电穿孔转染。具体观察时间和转染效率评定方法同上。3.4采用慢病毒载体将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染使用上述构建的有效质粒进行慢病毒载体包装,将包装好的慢病毒载体工作液稀释成1:5,1:10,1:50三个不同的浓度梯度进行转染各组细胞,具体观察时间和转染效率评定方法同上。3.5观察各组MVECs和HUVECs的细胞骨架、伪足形成将各组细胞进行细胞爬片,使用罗丹明标记的鬼笔环肽染液和DAPI染色,然后防淬灭液封片,使用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架;将各组细胞爬片使用锇酸固定,乙醇梯度脱水,干燥后使用扫描电子显微镜观察各组细胞伪足形态和数目。3.6观察各组MVECs和HUVECs迁移、二维成管和三维出芽能力分别将各组细胞在24孔板中培养待细胞铺满后,采用细胞划痕实验24h后检测各组细胞迁移能力;将各组细胞接种到Matrigel基质胶上,待细胞完全贴壁之

关键词：多发性骨髓瘤 RhoC 骨髓瘤血管内皮细胞人脐静脉内皮细胞

重离子辐照对舌癌Tca8113细胞中转移相关基因RhoC的作用

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实用口腔医学杂志 2016年第6期32卷 787-790页

作者：李春青冯正虎李馨张轩李志杰西北民族大学口腔医学国家民委重点实验室兰州730030 兰州大学口腔医学院

目的:探讨重离子辐照对舌癌侵袭转移相关基因RhoC的作用。方法:应用不同剂量重离子束(^(12)C^(6+))对体外培养的舌癌Tca8113细胞进行辐照,采用荧光实时定量PCR法及WesternBlot法观察细胞中RhoCmRNA及蛋白的表达变化。结果:与空白对照组... 详细信息

目的:探讨重离子辐照对舌癌侵袭转移相关基因RhoC的作用。方法:应用不同剂量重离子束(^(12)C^(6+))对体外培养的舌癌Tca8113细胞进行辐照,采用荧光实时定量PCR法及WesternBlot法观察细胞中RhoCmRNA及蛋白的表达变化。结果:与空白对照组比较,12C6+辐照后4h,各实验组细胞中RhoCmRNA的表达降低(PRhoCmRNA表达增加,随后各组细胞中RhoCmRNA表达再次下降(PRhoC蛋白表达量随辐照剂量的增加而增高,在4Gy时达到高峰;24h后随剂量的增加逐渐降低;在相同辐照剂量下,细胞中RhoC蛋白的表达随时间推移呈下降趋势,RhoC蛋白表达和RhoCmRNA表达的趋势相同。结论:12C6+重离子束可以下调舌癌Tca8113细胞中RhoC基因的表达。

关键词：重离子舌鳞癌 RhoC