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散在重复序列PCR检测肺炎支原体的方法建立及临床应用

散在重复序列PCR检测肺炎支原体的方法建立及临床应用

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作者：谷雅君天津医科大学

学位级别：硕士

目的：利用散在重复序列PCR技术,建立一种简便、快速、灵敏和特异的IRS-PCR方法并对临床标本进行肺炎支原体检测,用于肺炎支原体肺炎的早期诊断及复发检测。通过所建立的IRS-PCR方法对天津地区非典型肺炎患儿肺炎支原体的感染率进行调... 详细信息

目的：利用散在重复序列PCR技术,建立一种简便、快速、灵敏和特异的IRS-PCR方法并对临床标本进行肺炎支原体检测,用于肺炎支原体肺炎的早期诊断及复发检测。通过所建立的IRS-PCR方法对天津地区非典型肺炎患儿肺炎支原体的感染率进行调查,同时检测肺炎支原体抗体并收集该类患者呼吸道病毒感染的情况,了解不同病原体感染率的差异,为丰富国内儿童肺炎支原体感染的流行病学研究状况提供资料,同时为指导临床治疗提供依据。方法： 1.传代培养并测定肺炎支原体标准株Mac及临床分离菌株1836,4299的浓度。 2.针对肺炎支原体的P1基因散在重复序列,即repmp2/3设计17对引物,并进行引物筛选,包括标准菌株和临床分离菌株的检测及敏感性和特异性实验。10倍倍比稀释(至10-10CFU)标准菌株进行敏感性实验,特异性实验使用大肠埃希菌、解脲脲原体、沙眼衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、生殖支原体DNA。最后用筛选出的最佳引物建立散在重复序列PCR的方法(IRS-PCR),并进行反应体系的优化。采用L16(45)正交试验对筛选出引物的浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板DNA用量和Mg2+浓度进行五因素四水平优化,并按照预设计的正交表重复三次。并且用优化的最佳IRS-PCR做追加实验。 3.对IRS-PCR进行初步临床应用评价,选择150例非典型性肺炎患者的支气管肺泡灌洗液标本,提取DNA进行IRS-PCR。同时检测患者的肺炎支原体抗体,收集该类患者呼吸道病毒感染情况,并将检出率进行比较。结果： 1.菌株培养及浓度测定：液体培养基3-5天变色,固体培养基呈典型“油煎蛋”菌落,经鉴定为肺炎支原体。菌株浓度分别为Mac：107 CCU,106CFU/ml;1836：108CCU,106 CFU/ml;4299：107CCU,106CFU/ml。 2.IRS-PCR方法建立及优化：①经标准菌株和临床分离菌株的检测初步筛选出三对引物,即F3R2、F4R4和F6R4。敏感性实验显示,F6R4：10-9CFU,F3R2：10-8CFU,F4R4：10-8CFU。特异性实验显示,F6R4能够扩增出解脲脲原体、肺炎链球菌、甲型链球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、生殖支原体。F4R4能够扩增出大肠埃希菌和生殖支原体。F3R2特异性较好,亦无非特异条带,并且敏感性较高,因此我们选定F3R2为IRS-PCR引物。②正交试验所优化的最佳反应体系为引物F3R2 0.6umol/L、dNTP 0.3mmol/L、Taq酶1U/25ul、DNA 2CFU、Mg2+2.5mmol/L,且追加实验显示此反应体系为最佳组合。经过SPSS11.5统计软件分析,五种因素(引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板DNA用量和Mg2+浓度)对实验结果均有显著影响(PdNTP浓度>TaqDNA聚合酶浓度>Mg2+浓度>模板DNA用量。 3.临床标本检测：该法检测150例非典型性肺炎患者,阳性率为41%。肺炎支原体IgG抗体检测阳性15例,阳性率为10%。同期收集的呼吸道病毒检测结果显示,猪轮状病毒阳性者3例,人类呼吸道合胞病毒阳性者2例,腺病毒阳性者1例,其他病原体均为阴性,肺炎支原体的IRS-PCR检出率高于其他呼吸道病毒的检出率,差异有统计学意义(P2.天津地区非典型肺炎患儿肺炎支原体的检出率高于呼吸道病毒的检出率,临床上应该高度重视肺炎支原体的检查,更好的指导临床用药。

关键词：散在重复序列降落PCR 肺炎支原体 P1基因 repmp2/3 正交试验

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IRS-PCR诊断肺炎支原体肺炎的临床应用与评价

IRS-PCR诊断肺炎支原体肺炎的临床应用与评价

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作者：李双玉天津医科大学

学位级别：硕士

目的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是介于细菌与病毒之间,无细胞壁的一类原核细胞型生物。它不但是原发性非典型肺炎的重要病原体,也是成年人社区获得性肺炎的常见病原之一。近年来由于肺炎支原体感染的发病率不断升高,使人们... 详细信息

目的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是介于细菌与病毒之间,无细胞壁的一类原核细胞型生物。它不但是原发性非典型肺炎的重要病原体,也是成年人社区获得性肺炎的常见病原之一。近年来由于肺炎支原体感染的发病率不断升高,使人们对早期、快速检测肺炎支原体感染的方法越来越重视。现在临床上常用的肺炎支原体分离培养和血清学方法敏感性低,特异性差,耗时长,易出现假阴性,不能很好的满足临床需要。近年PCR技术的发展,为建立可靠、快速的肺炎支原体早期诊断方法提供了可能。Dr.Jensen报道的touch-down PCR方法和Dr. Alfred报道的PCR方法是检测肺炎支原体感染较为常见的方法,具有较高的灵敏度和特异性。本研究通过IRS-PCR方法与Dr.Jensen和Dr.Alfred的PCR方法的比较,评价IRS-PCR在诊断肺炎支原体肺炎中的应用价值。方法 1.标本来源：天津市某医院就诊的急性呼吸道感染患儿,共121例。由专业人员采集患儿咽拭子。从咽拭子中提取肺炎支原体DNA。 2.用三种PCR方法对121例患者进行肺炎支原体检测。三种方法分别是IRS-PCR、DrJensen的PCR和Dr.Alfred的PCR方法。对三种方法检测结果有差异的标本进行测序。 3.敏感性评价方法：用ddH2O10倍倍比稀释肺炎支原体标准菌株Mac提取的DNA,最终得到10个浓度递减的DNA样本,用三种PCR方法检测,可以判断三种方法的敏感性。 4.特异性评价方法：以14种病原体的DNA为模板,分别用三种PCR方法扩增,用2%的琼脂糖凝胶电泳分析结果来判断这三种方法的特异性。结果 1.IRS-PCR检出42例阳性患者,阳性率34.71%。Dr.Jensen的PCR检出46例阳性,阳性率38.01%,Dr.Alfred的PCR检出44例阳性,阳性率36.04%。三种PCR方法检测的结果不一致的标本：12、15、21和30,送测序,其结果为：12和15号标本阴性,21号和30号标本为阳性。 2.IRS-PCR方法和Dr. Alfred的PCR方法的敏感性优于DrJensen的PCR方法。 3.标准株Mac用IRS-PCR方法扩增,可扩增出503-525bp大小的特异性条带,大肠埃希菌用此法扩增出600bp左右大小的条带,因为大肠埃希菌扩增出的条带与目的条带大小差异大,距离比较远,不影响检测结果的特异性。DrJensen的PCR和Dr.Alfred的PCR除了标准株Mac扩出特异性条带外,其余病原体均未发现非特异性条带。三种方法均有高度的特异性。结论 1.IRS-PCR方法与DrJensen和Dr. Alfred的PCR法比较,三种方法的检测结果的符合率高,方法一致性好,所以IRS-PCR可以用于临床肺炎支原体肺炎的诊断。 2.IRS-PCR法操作简便,其特异性和敏感性也与上述两种方法没有差别,该法可以在国内推广。

关键词：肺炎支原体 P1基因 repmp2/3 聚合酶链反应

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