散在重复序列PCR检测肺炎支原体的方法建立及临床应用

作     者：谷雅君 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘运德

授予年度：2010年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：散在重复序列 降落PCR 肺炎支原体 P1基因 RepMP2/3 正交试验 

摘      要：目的： 利用散在重复序列PCR技术,建立一种简便、快速、灵敏和特异的IRS-PCR方法并对临床标本进行肺炎支原体检测,用于肺炎支原体肺炎的早期诊断及复发检测。通过所建立的IRS-PCR方法对天津地区非典型肺炎患儿肺炎支原体的感染率进行调查,同时检测肺炎支原体抗体并收集该类患者呼吸道病毒感染的情况,了解不同病原体感染率的差异,为丰富国内儿童肺炎支原体感染的流行病学研究状况提供资料,同时为指导临床治疗提供依据。 方法： 1.传代培养并测定肺炎支原体标准株Mac及临床分离菌株1836,4299的浓度。 2.针对肺炎支原体的P1基因散在重复序列,即RepMP2/3设计17对引物,并进行引物筛选,包括标准菌株和临床分离菌株的检测及敏感性和特异性实验。10倍倍比稀释(至10-10CFU)标准菌株进行敏感性实验,特异性实验使用大肠埃希菌、解脲脲原体、沙眼衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、生殖支原体DNA。最后用筛选出的最佳引物建立散在重复序列PCR的方法(IRS-PCR),并进行反应体系的优化。采用L16(45)正交试验对筛选出引物的浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板DNA用量和Mg2+浓度进行五因素四水平优化,并按照预设计的正交表重复三次。并且用优化的最佳IRS-PCR做追加实验。 3.对IRS-PCR进行初步临床应用评价,选择150例非典型性肺炎患者的支气管肺泡灌洗液标本,提取DNA进行IRS-PCR。同时检测患者的肺炎支原体抗体,收集该类患者呼吸道病毒感染情况,并将检出率进行比较。 结果： 1.菌株培养及浓度测定：液体培养基3-5天变色,固体培养基呈典型“油煎蛋菌落,经鉴定为肺炎支原体。菌株浓度分别为Mac：107 CCU,106CFU/ml;1836：108CCU,106 CFU/ml;4299：107CCU,106CFU/ml。 2.IRS-PCR方法建立及优化：①经标准菌株和临床分离菌株的检测初步筛选出三对引物,即F3R2、F4R4和F6R4。敏感性实验显示,F6R4：10-9CFU,F3R2：10-8CFU,F4R4：10-8CFU。特异性实验显示,F6R4能够扩增出解脲脲原体、肺炎链球菌、甲型链球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、生殖支原体。F4R4能够扩增出大肠埃希菌和生殖支原体。F3R2特异性较好,亦无非特异条带,并且敏感性较高,因此我们选定F3R2为IRS-PCR引物。②正交试验所优化的最佳反应体系为引物F3R2 0.6umol/L、dNTP 0.3mmol/L、Taq酶1U/25ul、DNA 2CFU、Mg2+2.5mmol/L,且追加实验显示此反应体系为最佳组合。经过SPSS11.5统计软件分析,五种因素(引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板DNA用量和Mg2+浓度)对实验结果均有显著影响(PdNTP浓度TaqDNA聚合酶浓度Mg2+浓度模板DNA用量。 3.临床标本检测：该法检测150例非典型性肺炎患者,阳性率为41%。肺炎支原体IgG抗体检测阳性15例,阳性率为10%。同期收集的呼吸道病毒检测结果显示,猪轮状病毒阳性者3例,人类呼吸道合胞病毒阳性者2例,腺病毒阳性者1例,其他病原体均为阴性,肺炎支原体的IRS-PCR检出率高于其他呼吸道病毒的检出率,差异有统计学意义(P0.05)。 结论： 1.IRS-PCR操作简便、灵敏度高、特异性强,非常适合临床实验室用于肺炎支原体的检测,尤其是大规模筛查。当然,实际效果尚有待于大规模临床实验的确证,但可以预见,随着研究的深入,这项技术有可能成为肺炎支原体最令人满意的早期诊断及复发检测方法。 2.天津地区非典型肺炎患儿肺炎支原体的检出率高于呼吸道病毒的检出率,临床上应该高度重视肺炎支原体的检查,更好的指导临床用药。