检索结果-南通市图书馆

作者：王昱扬州大学

学位级别：硕士

短喙与矮小综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)自2015年爆发以来,对我国樱桃谷鸭养殖业造成了很大损失,感染鸭以体型矮小、喙短、站立行走困难为特征。新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,NGPV)为SBDS的病原。先前研究显... 详细信息

短喙与矮小综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)自2015年爆发以来,对我国樱桃谷鸭养殖业造成了很大损失,感染鸭以体型矮小、喙短、站立行走困难为特征。新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,NGPV)为SBDS的病原。先前研究显示,早期的NGPV分离株与2019年后的分离株在樱桃谷鸭胚适应性上存在明显差异。NGPV在田间流行已有七年,近年来的流行株是否产生新的变异尚不清楚。非结构蛋白rep1在NGPV致病性和SBDS特征性临床症状的呈现上发挥决定性作用,对rep蛋白开展深入研究对揭示NGPV致病机制十分关键。本论文研究中,对2021-2022年的NGPV分离株进行了基因组测序和遗传进化分析,对Rep1蛋白全长及其亚片段开展了基于原核系统的表达并研制了针对表达产物的多克隆抗体,研究结果为进一步探究NGPV致病性和致病机理奠定了基础,具体内容如下:一、三株NGPV的分离、定序及遗传进化分析从2021-2022年间收集的三份疑似SBDS阳性的组织样品,通过接种樱桃谷鸭胚,分离到三株NGPV,分别命名为SDDY21、SDJN21和SDWF22株。三株病毒传代后稳定在69-142 h内致死鸭胚。SDWF22株第三代鸭胚传代毒的ELD50为5×105 26/mL,非常接近于2019年分离株SDJN19(5×105.5/mL),而明显高于2016年分离株SDHT16(5×102.5/mL)。三个分离株的基因组均由5 054个核苷酸组成,这三个分离株与2019年NGPV分离株SDLC19和SDJN19的同源性为99.5%-99.8%,而与2016年分离株SDHT16的同源性略低,为98.7%-98.8%。三个分离株的末端倒置重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)均由418个核苷酸组成,与SDJN19株ITR的同源性均为100%,而这四个毒株的ITR与2016年分离株SDHT16和AH1605的同源性略低,分别为98.1%和98.6%,后者的ITR由416个核苷酸组成。三个分离株的rep1编码框均由1 884 nt组成,彼此同源性高达99.9%-100%。三个毒株Rep1蛋白与2015-2016年NGPV分离株的核苷酸同源性略低,为98.9%-99.1%,与2019年分离株SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%;相比之下,三个毒株与经典型GPV的Rep1蛋白核苷酸同源性仅为96.0%-96.8%,其中同源性最高的为来自匈牙利的GPV B株,同源性为96.8%。Rep1蛋白氨基酸序列比对显示,与经典型GPV毒株相比,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株呈现出11个特征性的氨基酸点突变。三个新分离株,除了与其它NGPV毒株具有一致的特征性氨基酸位点外,还在7个位点上形成了自身的特征性氨基酸,而2019年分离株在这些位点上的氨基酸则呈现出过渡特征。SDDY21、SDJN21、SDWF22三个毒株的VP1 蛋白均由2 199个核苷酸组成,彼此间核苷酸同源性为99.7%-99.8%,与SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%,与 2015-2016 年间的 6 个分离株(JS1、SDLC01、AH1605、AH0606、QH15 和 ADHT16)的同源性为98.6%-98.9%。相比之下,这三个新NGPV分离株与大陆和台湾地区经典GPV毒株的VP1核苷酸同源性仅有94.4%-94.8%,而与欧洲的GPVB株的同源性则略高,为96.0%-96.1%。进一步的氨基酸序列比对显示,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株与经典型GPV毒株之间具有14个特征性氨基酸差异,在这些差异氨基酸位点中,有9个位点(28、35、41、207、210、524、537、575和703位)与欧洲的B株相一致。结果提示,流行于我国樱桃谷鸭中的NGPV更有可能在欧洲的B株基础上演变而来。以rep1和VP1构建的遗传发生树均显示所有NGPV毒株形成了不同于经典型GPV的独立分支,但同时也显示,三个新分离株与2019年的分离株处于一个亚分支,而SBDS爆发早期的分离株则处于另一个更为紧密的亚分支。二、NGPV Rep1蛋白及其亚片段的原核表达和多抗制备NGPV与经典型GPV的rep 1蛋白之间存有特征性氨基酸差异,rep 1蛋白在NGPV致病性上发挥关键作用。Rep1蛋白的N端和C端分布有不同的功能结构域。原核系统表达Rep1蛋白的研究已多有报道,但大多以包涵体状态存在。本研究中,通过对表达载体、诱导温度、IPTG浓度进行试验比较,最终选择以pET-28a载体表达rep1的N端200个氨基酸片段(后文简称为rep1N),以pGEX-6p-1为载体表达Rep1蛋白及Rep1蛋白的C端200个氨基酸(后文简称为rep1C)。三个蛋白均在大肠杆

关键词：新型鹅细小病毒病毒分离遗传进化树原核表达 Rep1蛋白多克隆抗体

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鹅细小病毒Rep1蛋白的原核表达及抗体制备

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2015年第4期36卷 5-8页

作者：王建业段进坤朱国强扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为深入研究鹅细小病毒(GPV)rep蛋白的功能,采用PCR方法扩增出完整的rep1基因,并克隆入原核表达载体pET-28a(+)。将重组质粒pET28-rep1导入到大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE分析表明:37℃下经1mmol·L^(-1) IPTG诱导4h,Rep1蛋白可... 详细信息

为深入研究鹅细小病毒(GPV)rep蛋白的功能,采用PCR方法扩增出完整的rep1基因,并克隆入原核表达载体pET-28a(+)。将重组质粒pET28-rep1导入到大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE分析表明:37℃下经1mmol·L^(-1) IPTG诱导4h,Rep1蛋白可获得高效表达。重组蛋白经切胶免疫BALB/c小鼠制备针对Rep1蛋白的多克隆抗体。经间接免疫荧光检测,1∶1 000稀释的多抗能特异性识别在鹅胚成纤维细胞上增殖的GPV抗原,说明所制备的多抗具有良好反应原性,可用于后续针对rep蛋白的相关功能研究。

关键词：鹅细小病毒 Rep1蛋白原核表达间接免疫荧光

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番鸭细小病毒Rep1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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中国家禽 2018年第6期40卷 15-18页

作者：王志仙凌珏怡贾婧宇王建业朱国强扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

rep蛋白在番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染中的作用尚不清楚。研究将MDPV的rep1基因克隆入p ET-28a原核表达载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG诱导下成功表达了分子量约为82 ku的目的蛋白,菌体分析表明目的蛋白主要... 详细信息

rep蛋白在番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染中的作用尚不清楚。研究将MDPV的rep1基因克隆入p ET-28a原核表达载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG诱导下成功表达了分子量约为82 ku的目的蛋白,菌体分析表明目的蛋白主要以包涵体存在。将重组蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对Rep1蛋白的多克隆抗体。在间接免疫荧光试验中,rep1多克隆抗体能与鹅胚成纤维细胞上增殖的MDPV特异性发生反应,免疫印迹试验则显示rep1多克隆抗体能够在MDPV感染的GEF中识别出两条蛋白条带rep1和rep2。结果表明制备的rep1多克隆抗体具有良好反应特异性,为深入研究rep蛋白在MDPV感染中的作用奠定了基础。

关键词：番鸭细小病毒 Rep1蛋白原核表达间接免疫荧光试验

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