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小麦生理型雄性不育与组蛋白泛素化修饰及rad6基因表达相关性研究

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小麦生理型雄性不育与组蛋白泛素化修饰及RAD6基因表达相关性研究

作者：桑青西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦杂种优势利用与雄性不育机理的研究,多年来一直是世界性设法攻克的科学难关。小麦雄性不育可分为遗传型不育与生理型不育两种类型,生理型不育,即化学杂交剂诱导后产生的雄性不育,该途径培育出的杂交小麦现已较大面积走向生产,为突... 详细信息

小麦杂种优势利用与雄性不育机理的研究,多年来一直是世界性设法攻克的科学难关。小麦雄性不育可分为遗传型不育与生理型不育两种类型,生理型不育,即化学杂交剂诱导后产生的雄性不育,该途径培育出的杂交小麦现已较大面积走向生产,为突破杂交小麦生产应用关创造了极好的条件。小麦遗传型雄性不育机理研究,过去几年已有报道,但由于育性基因的复杂性均未获得实质性进展。本文则是回避了遗传型雄性不育育性基因的复杂性,依据生理型雄性不育形成的特点,即与其受体植株自身育性功能基因变异无直接关系,重在与育性基因在转录调控与蛋白质表达过程中的变异性密切相关(生理型雄性不育性不遗传给后代,完全是当代诱导后的雄性不育表达)。另外,根据近年来表观遗传学研究进展,组蛋白的泛素化,甲基化,乙酰化等修饰作用共同形成了“组蛋白密码”,在基因转录调控中起关键性作用。在泛素修饰研究前沿的医学领域,不少研究成果证明组蛋白的泛素化在精子变态,细胞周期的有丝分裂过程,以及抑制干细胞过早成熟、过早分化基因的表达过程中都起到关键作用。在植物方面,过去多年研究均证实,植物雄性不育小孢子败育,均与小孢子异常分裂直接相关,而新近研究又指出组蛋白H2B的泛素化与细胞周期有丝分裂过程关系密切。又有研究发现在哺乳动物体内,rad6(催化H2B单泛素化活性的E2结合酶)有2个同源蛋白HR6A和HR6B,敲除小鼠体内的HR6B,小鼠表现为雄性不育,不育的原因是在泛素结合过程中存在缺陷,由此推测,rad6和组蛋白H2B的泛素化修饰与育性密切相关。本研究基于上述研究进展,又以小麦杀雄剂途径可为研究小麦雄性不育分子机理提供的极好条件,即同一基因型背景以喷施杀雄剂定向诱导的生理型雄性不育与未喷施杀雄剂(喷施清水作为对照)的对应可育构建成严格的不育与可育等生理系,试图利用western blot测定出小麦小花不同发育时期的组蛋白泛素化水平,同时结合rad6在不同时期表达量的变化来进一步分析组蛋白H2B泛素化水平与生理型雄性不育的相关性。获得结论如下： (1)利用酸提法从小麦核蛋白中分离出的组蛋白浓度较高,纯度较好,而且该方法省时省力,快捷可靠,重复性较好,可适用于其他植物组蛋白的提取,为植物“组蛋白密码”的相关研究奠定了基础。 (2)本研究首次在小麦上立足组蛋白修饰研究前沿,通过Western blot方法研究小麦可育系与不育系之间组蛋白泛素化水平发现,在严格一致的实验条件下,只有组蛋白H2A、H2B、H3发生了泛素化修饰,其中组蛋白H2B的泛素化水平最高且差异最大。在可育系中,组蛋白H2B在单核期的泛素化水平明显高于二核期和三核期;在不育系中,组蛋白H2B的泛素化修饰水平在二核期最高;二者相比,尤其在单核期,小麦小花组蛋白H2B的泛素化水平在可育系与不育系之间存在极显著差异,可育系的组蛋白H2B的泛素化修饰水平是不育系的5.47倍。随后可育系中H2B的泛素化水平逐渐降低,而不育系中H2B的泛素化水平先上升,后下降,直到三核期与可育系持平。组蛋白H2A的泛素化水平较低,仅在单核期和二核期发生,且在单核期仅发生在可育系中;组蛋白H3的泛素化修饰在不同材料的各个时期都有发生,但是他们之间差异不大。由此可见,在小麦小花败育的关键时期—单核期,由于化学杀雄剂SQ-1的诱导作用,组蛋白H2A、 H2B的泛素化修饰水平明显受到抑制。 (3)克隆rad6(催化组蛋白H2A、H2B泛素化的E2酶)基因的功能片段并对其进行生物信息学分析发现rad6属于泛素结合酶家族,参与蛋白的泛素化,含有184个氨基酸,其分子量为23KDa。在不同物种的序列之间仍具有较多的高度保守序列或相同的活性中心,该蛋白中26-137氨基酸残基序列是泛素结合酶E2I型家族的保守序列,其中73-89残基部位的17个氨基酸(YHPNVDEMSGSVCLDVI)是泛素结合酶的活性中心部位,位于N端第85位的半胱氨酸残基(C)在泛素-E2硫酯键形成中具有催化作用。 (4)采用实时荧光定量PCR技术分析基因rad6的表达特性,结果显示,在可育株和不育株中,rad6基因的表达量在各个时期的变化趋势与组蛋白H2B泛素化水平的变化趋势相一致;尤其在单核期,可育株小花rad6基因的表达水平是杀雄剂SQ-1诱导的不育株小花的20.47倍,不育株小花rad6基因的表达明显受到抑制。这表明在小麦生理型雄性不育败育关键期(单核期),不育系小花中rad6基因的表达水平和组蛋白泛素化水平异常,是引起小麦生理型败育的关键所在。由此可见,小麦组蛋白泛素化水平与生理型雄性不育密切相关。这为小麦雄性不育组蛋白泛素化调控机制提供了科学依据,进而为深入探究小麦雄性不育机理奠定了坚实的表观遗传研究基础。

关键词：小麦杀雄剂SQ-1 免疫印迹组蛋白泛素化 rad6 荧光定量PCR

E2泛素交联酶rad6在人类细胞周期中调控基因表达的机制研究

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E2泛素交联酶RAD6在人类细胞周期中调控基因表达的机制研究

作者：姜文杰山东大学

学位级别：硕士

细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次分裂结束,由一个细胞分裂为两个相同子细胞的过程,是细胞最基本的反应。要保证整个分裂过程的精确性,就必须对细胞周期进程中相关基因的表达进行精确的调控,以确保细胞周期中... 详细信息

细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次分裂结束,由一个细胞分裂为两个相同子细胞的过程,是细胞最基本的反应。要保证整个分裂过程的精确性,就必须对细胞周期进程中相关基因的表达进行精确的调控,以确保细胞周期中各个事件的有序运行。在细胞内,有一系列的机制调控着整个网络的正常运行,而蛋白的泛素化修饰便是其中至关重要的一环。蛋白的泛素化修饰在蛋白质的降解和功能调节中起着重要的作用。泛素化修饰过程一般需要三类酶来参与,分别是E1泛素激活酶、E2泛素交联酶以及E3泛素-蛋白连接酶。这三类酶协同作用,可以为特定的蛋白质底物打上不同形式的泛素化修饰(单泛素化或者多泛素化)。现在,人们对于蛋白质的多泛素化修饰已经有了足够深入的了解,普遍认为多泛素化修饰一般会导致底物蛋白质的降解。生物体内折叠异常或者功能执行完毕的蛋白质会先被打上多泛素化的标签,然后通过“泛素-蛋白酶体”途径被降解掉。单泛素化修饰对蛋白质的影响往往比较复杂,它一般不会导致蛋白质底物的降解,而是对其生物学功能有着重要的调控作用。rad6就是一种相当重要的E2泛素交联酶,它广泛地参与到诸如DNA损伤修复、组蛋白修饰以及基因表达等多种生物学过程中。本研究首先在人类肝脏细胞HL-7702中对rad6分别进行过表达和沉默实验,然后检测HL-7702细胞在细胞周期进程以及细胞增殖能力方面的变化。实验结果表明过表达rad6能够促进细胞从G1期向S期转变,增强细胞的增殖能力,而rad6的沉默所产生影响则截然相反。因为早有许多文献报道细胞周期蛋白D1(CCND1)是决定细胞从G1期向S期转变的关键因子,由此可以推测rad6对细胞的影响可能是通过调控CCND1的表达来实现的。对CCND1表达水平的分析以及RNA干扰实验的结果也证实rad6确实是通过调控CCND1的表达来实现对细胞周期进程以及细胞增殖能力的影响。为了进一步了解rad6调控CCND1表达的分子机制,本研究通过染色质免疫共沉淀实验来分析rad6对CCND1启动子区域组蛋白的影响。实验结果表明过表达rad6能够提高CCND1基因启动子区域中组蛋白H2B的单泛素化的水平和H3K4三甲基化的水平,从而促进CCND1的转录。在了解了rad6与CCND1的相互作用对于细胞周期进程以及细胞增殖的影响后,本研究又通过生物信息学的方法来分析其在临床上的应用价值。Kaplan-Meier生存率分析和基因表达水平的分析均表明,在乳腺癌病人的临床样品中rad6与CCND1之间存在明确的对应关系,能在一定程度上反映出癌症的发生与发展,为病人的治疗提供了理论基础。综上所述,本研究系统地阐述了在人类细胞中rad6通过调控CCND1的表达来参与细胞周期进程的调节,进而调控了细胞的增殖。这一分子机制的发现填补了相关基础领域的理论空白。同时,临床样品的分析结果也使得rad6与CCND1有望成为乳腺癌分子诊断及预后的分子标志物,对临床医学也具有重要的应用价值。

关键词：细胞周期泛素化 rad6 CCND1 组蛋白修饰

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rad6在肺腺癌中的表达及临床意义

临床与病理杂志 2019年第12期39卷 2680-2684页

作者：钱静石宇南通大学附属医院肿瘤放疗科

目的:研究rad6在肺腺癌组织中的表达情况,探讨其与肺腺癌预后的相关性。方法:选择92例有完整随访资料的肺腺癌患者的新鲜癌组织及相应的癌旁正常肺组织标本(距肿瘤边缘>5 cm),应用免疫组织化学EnVision两步法,分别检测癌组织及癌旁正常... 详细信息

目的:研究rad6在肺腺癌组织中的表达情况,探讨其与肺腺癌预后的相关性。方法:选择92例有完整随访资料的肺腺癌患者的新鲜癌组织及相应的癌旁正常肺组织标本(距肿瘤边缘>5 cm),应用免疫组织化学EnVision两步法,分别检测癌组织及癌旁正常肺组织中rad6蛋白的表达水平。结果:肺腺癌组织中rad6的蛋白表达水平明显高于癌旁正常肺组织(61.96%vs 38.04%,Prad6高表达者总生存率明显下降(Prad6在肺腺癌组织中的表达水平高于相应癌旁正常肺组织,且肿瘤分化程度越低,rad6蛋白的表达水平越高,生存时间越短,提示rad6过表达与肺腺癌的发生发展及预后有关。

关键词： rad6 靶基因肺腺癌

rad6在脑胶质母细胞瘤中的表达及临床意义

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临床与病理杂志 2016年第8期36卷 1140-1143页

作者：包元飞田薇熊云云南通市第三人民医院神经内科江苏南通226000 南通大学附属医院病理科江苏南通226000 南京军区南京总医院神经内科南京210000

目的:研究rad6在脑胶质母细胞瘤中的表达及临床意义。方法:在组织水平,使用免疫组织化学方法检测32例脑胶质母细胞瘤组织及21例瘤旁正常组织中rad6的表达,应用SPSS17.0统计软件,分析rad6表达与临床病理参数及预后的关系。结果:rad6在胶... 详细信息

目的:研究rad6在脑胶质母细胞瘤中的表达及临床意义。方法:在组织水平,使用免疫组织化学方法检测32例脑胶质母细胞瘤组织及21例瘤旁正常组织中rad6的表达,应用SPSS17.0统计软件,分析rad6表达与临床病理参数及预后的关系。结果:rad6在胶质母细胞瘤组织及瘤旁正常组织中阳性率分别为65.63%、28.57%(χ2=6.97;P=0.009)。经K aplan-Meier法生存比较,R ad6的阳性表达者比阴性表达者生存期短(Prad6蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、血管密度、肿瘤直径及坏死无关,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:rad6过度表达与脑胶质母细胞瘤有关,有望成为胶质母细胞瘤新的预后基因。

关键词：脑胶质母细胞瘤 rad6 预后

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泛素结合酶rad6的结构与功能研究进展

热带农业科学 2013年第2期33卷 36-41页

作者：覃碧邓治刘长仁李德军中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室海南儋州571737 海南大学农学院海南海口570228

泛素复合体对蛋白的修饰可以改变蛋白定位、活性和稳定性。泛素结合酶E2在其中起关键作用。rad6是典型的泛素结合酶,在泛素复合体组装、DNA损伤修复、调控基因表达和细胞周期等生理过程中具有重要作用。本文综述了rad6蛋白的结构、与其... 详细信息

泛素复合体对蛋白的修饰可以改变蛋白定位、活性和稳定性。泛素结合酶E2在其中起关键作用。rad6是典型的泛素结合酶,在泛素复合体组装、DNA损伤修复、调控基因表达和细胞周期等生理过程中具有重要作用。本文综述了rad6蛋白的结构、与其互作的泛素蛋白连接酶E3及其功能研究进展,并展望其在作物研究中的应用。

关键词：泛素泛素结合酶E2 rad6 结构功能

Bre1与rad6形成的复合物的表达、纯化和结晶

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天津医科大学学报 2023年第1期29卷 83-87页

作者：赵佳奇石萌向嵩天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系天津300070

目的:建立Bre1及rad6的表达和纯化方法,构建Bre1-rad6的复合物,寻找复合物的结晶条件,为使用X射线晶体学的方法解析复合物的结构奠定基础。方法:使用大肠杆菌表达系统表达蛋白质;使用共纯化的方法组装复合物;使用气象扩散的方法结晶复... 详细信息

目的:建立Bre1及rad6的表达和纯化方法,构建Bre1-rad6的复合物,寻找复合物的结晶条件,为使用X射线晶体学的方法解析复合物的结构奠定基础。方法:使用大肠杆菌表达系统表达蛋白质;使用共纯化的方法组装复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物。结果:建立了来源于Lodderomyces elongisporus的Bre1(LeBre1)氮端与rad6相互作用的结构域(RBD)和rad6(Lerad6)在大肠杆菌中大量表达的方法;通过使用共纯化的方法,成功组装了LeBre1 RBD-rad6复合物,并进一步通过两步凝胶过滤层析纯化的方法精细纯化,获得了纯度超过95%的蛋白复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物,在18℃通过对1 000多个结晶条件的筛选,确定了复合物的两种结晶条件,进一步对该条件优化,获得了质量相对较好的晶体。结论:成功的构建了LeBre1 RBD-rad6复合物的表达、纯化和结晶的方法,为使用X射线晶体学方法解析复合物的结构奠定了基础。

关键词： Bre1 rad6 泛素化修饰蛋白质纯化蛋白质结晶

泛素交联酶rad6在DNA损伤修复中的作用

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医学分子生物学杂志 2013年第4期10卷 233-237页

作者：欧阳思维田迎霞景玉宏宋焱峰张朗刘向文王德贵兰州大学基础医学院人体解剖学教研室兰州市730000

rad6最初是在酿酒酵母（***）中发现的一种具有催化H2B单泛素化活性的泛素交联酶（E2），它具有一个UBCc结构域。早些年，人们对泛素系统在DNA损伤修复（DNA—damagerepair，DDR）中的作用了解非常有限。近年来，泛素在DNA损伤修复中蛋... 详细信息

rad6最初是在酿酒酵母（***）中发现的一种具有催化H2B单泛素化活性的泛素交联酶（E2），它具有一个UBCc结构域。早些年，人们对泛素系统在DNA损伤修复（DNA—damagerepair，DDR）中的作用了解非常有限。近年来，泛素在DNA损伤修复中蛋白质招募过程中扮演的广泛角色逐渐被人们所认识。rad6高度保守，能与多个泛素连接酶相互作用，在DDR中发挥重要作用。

关键词：泛素交联酶 rad6 泛素化 DNA损伤修复

泛素结合酶rad6多克隆抗体的制备及初步鉴定

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中国处方药 2016年第9期14卷 25-27页

作者：郭莲娣王鑫王小军西南民族大学药学院药学教研室成都610041 四川大学华西第二医院基因组稳定性实验室成都610041

目的为了给rad6参与的泛素化修饰相关领域的研究提供参考,在大肠杆菌中原核细胞表达GST-rad6重组蛋白并通过免疫家兔制备其多克隆抗体。方法以c DNA文库作为模板,构建重组载体p ET41a-GST-rad6,转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,诱导表达... 详细信息

目的为了给rad6参与的泛素化修饰相关领域的研究提供参考,在大肠杆菌中原核细胞表达GST-rad6重组蛋白并通过免疫家兔制备其多克隆抗体。方法以c DNA文库作为模板,构建重组载体p ET41a-GST-rad6,转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,诱导表达并纯化GSTrad6融合蛋白,免疫家兔后制备其多克隆抗体,通过Western-Blot检测及染色质免疫共沉淀鉴定其特异性及效价。结果成功构建了p ET41aGST-rad6重组载体,得到了高纯度的重组蛋白,Western-Blot检测及染色质免疫共沉淀鉴定显示获得的血清抗体效价高,特异性强。结论成功制备的高效价兔抗人rad6血清抗体可为rad6调控的泛素化修饰相关领域的研究奠定基础。

关键词： rad6 重组蛋白多克隆抗体

低剂量辐射对大鼠血管平滑肌细胞rad6基因的表达及细胞周期的影响

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北京大学学报(医学版) 1998年第5期30卷 8-8页

作者：郭卫东贾廷珍朱应葆吕愈敏北京医科大学第三医院肿瘤与放射病研究室

自８０年代初，Ｌｕｃｋｅｙ提出低剂量辐射兴奋效应概念后，人们对这方面的研究日益深入，已进入分子水平，对其机制和调控的研究已成为放射生物学研究的热点之一。我们以大鼠血管平滑肌细胞（ＷＫＹ１）为实验对象，用细胞原位杂交... 详细信息

自８０年代初，Ｌｕｃｋｅｙ提出低剂量辐射兴奋效应概念后，人们对这方面的研究日益深入，已进入分子水平，对其机制和调控的研究已成为放射生物学研究的热点之一。我们以大鼠血管平滑肌细胞（ＷＫＹ１）为实验对象，用细胞原位杂交和流式细胞术研究了低剂量辐射时ＤＮ...

关键词：低剂量大鼠血管平滑肌细胞 rad6 细胞周期细胞生活周期基因