RNA干扰RAD6增加秀丽隐杆线虫对UV损伤的敏感性

作     者：李松 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王德贵

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：秀丽隐杆线虫 RAD6 RNA干扰 紫外线 

摘      要：目的:紫外线是造成机体DNA损伤的重要来源。当DNA损伤后机体会启动DNA损伤修复机制来修复损伤的DNA。目前已知的修复途径包括核苷酸切除修复(NER)和同源末端连接(HR)。RAD6(UBC-1)DNA复制后泛素化修饰途径中E2的一个重要的酶。DNA损伤修复缺陷会导致机体对紫外线损伤敏感性增加,突变乃至肿瘤发生。本研究通过RNAi干扰秀丽隐杆线虫RAD6(UBC-1)基因的表达,研究其在DNA损伤后修复中作用机制。方法:通过RNA提取技术获取野生型秀丽隐杆线虫的总RNA,通过反转录PCR获取的cDNA文库。用特异性的引物扩增目的基因(UBC-1)。通过琼脂糖电泳分离纯化目的基因。通过T4连接酶的作用把UBC-1的cDNA转移到酶切的pUC57载体质粒上。通过转化***5α菌株,获取阳性克隆,扩增阳性克隆菌株。通过质粒提取技术获得大量的带有UBC-1基因序列的质粒。扩增含有L4440质粒的***15(DE3),提取其质粒。将获得的pUC57-UBC-1质粒和L4440质粒通过双酶切,琼脂糖凝胶电泳,通过DNA琼脂糖回收试剂盒获取目的片段。将纯化的目的片段用T4连接酶连接,形成连接复合物,转入感受态的HT115菌中,最终获取L4440-UBC-1的***115菌株,挑选单克隆阳性菌株。增菌,提取质粒,测序鉴定。本研究以秀丽隐杆线虫作为动物模型,采用喂食法来干扰线虫体RAD6(UBC-1)基因构建UBC-1缺失或者降低的线虫模型,并对RNAi效果以及RNAi干扰后线虫亚型经行观察。采用real time PCR技术检测UBC-1基因mRNA表达量。通过不同UV剂量的照射RNAi秀丽隐杆线虫确定实验剂量,确定100mJ 254nm UVC照射剂量并观察不同条件下线虫生命周期、产卵数目的变化和mRNA表达水平。结果:克隆线虫UBC-1基因,通过双酶切质粒做琼脂糖凝胶电泳和和生物测序鉴定,将该基因克隆到L4440载体,转化L4440-UBC-1及对照L4440载体到***115(DE3)中。通过Real time PCR技术,对野生型和RNAi线虫UBC-1 mRNA含量检测,验证干扰效果。RNA干扰的线虫UBC-1基因的mRNA水平表达量较野生型线虫下降了 78.1%。成功构建了 UBC-1 RNAi干扰线虫模型。干扰线虫的***寿命较野生型线虫缩短了 20%左右。RNAi干扰组线虫的产卵量与正常产卵组没有显著变化,产卵期提前一天,产卵周期增加了3天。在紫外线的作用下线虫的产卵和孵化率明显下降,产卵期和产卵周期没有变化测定不同UVC剂量照射下线虫的死亡率,确定100mJUVC剂量为本实验照射剂量。本实验采用100mJ的UVC剂量照射线虫,对线虫的体长、产卵数、孵化率、头部摆动频率进行计数。RNAi线虫对射线更敏感,紫外线照射的线虫产卵数和虫卵孵化数都明显降低。对mRNA水平分析采按如下方法进行:同步化线虫,分为RNAi组和Wild组,待秀丽隐杆线虫长满NGM平板,用100mJ的UVC照射,分别在照射0,4,15,20h后提取线虫总RNA,做RT-PCR,测定15个基因的mDNA含量,并作统计学分析。结果显示UBC-1干扰组mre-11、cep-1表达较对照组明显增高。结论:RAD6作为泛素交联酶E2的一个关键酶,在促进秀丽隐杆线虫生长发育,维持秀丽隐杆线虫的正常形态、生殖细胞发育和虫卵孵化等过程中发挥重要作用;在DNA损伤修复反应中,RAD6通过激活下游的XPC-1、XPG-1和XPA-1等多种蛋白进行DNA损伤修复,当RAD6基因缺陷细胞在DNA损伤后通过启动MRE-11/CEP-1通路诱导细胞凋亡。