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作者：张丽娜山东大学

学位级别：硕士

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒1型(hIV-1)感染引起的获得性免疫缺陷综合征,严重危害人类生命健康。临床上对艾滋病的治疗主要依赖于“高效抗逆转录病毒疗法”(hAART)。hAART可以有效地抑制病毒的复制,极大地降低感染者的发病率和死... 详细信息

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒1型(hIV-1)感染引起的获得性免疫缺陷综合征,严重危害人类生命健康。临床上对艾滋病的治疗主要依赖于“高效抗逆转录病毒疗法”(hAART)。hAART可以有效地抑制病毒的复制,极大地降低感染者的发病率和死亡率。但目前的联合抗病毒疗法不能治愈艾滋病,且终身服药会引起严重的毒副作用和耐药病毒株的产生,从而限制了现有药物的疗效。因此,迫切需要开发新型的抗hIV-1药物,尤其是作用于新靶点或具有新机制的药物,为现有的hAART提供更多的配伍选择,这对于克服现有药物的耐药性具有重要的意义。hIV-1逆转录酶(RT)是hIV-1生命周期中的关键酶,负责将病毒单链RNA逆转录为病毒双链DNA。RT包含两个不同的结构域:DNA聚合酶结构域(具有RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性)和核糖核酸酶h(rnase h)结构域(参与逆转录过程中形成的RNA/DNA异源杂合双链中RNA模板的水解)。目前,所有已批准上市的抑制RT的抗hIV药物,包括核苷(酸)类逆转录酶抑制剂(N(t)RTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs),都只针对RT的DNA聚合酶活性,而尚无针对rnase h功能的抑制剂进入临床阶段。鉴于rnase h在hIV-1生命周期中发挥着关键作用,开发rnase h抑制剂具有重要的科学意义。根据作用机制的不同,目前公开报道的rnase h抑制剂可分为活性位点抑制剂和变构抑制剂,其中对活性位点抑制剂的研究较为广泛,是rnase h抑制剂研发的重点。然而,大多数活性位点抑制剂由于其结构特点而存在诸如选择性差、细胞毒性大、透膜性差和抗病毒活性弱等缺点,从而止步于临床研究阶段。因此,针对rnase h靶标开发高活性及成药性的抗艾滋病药物仍然是科研工作者需要努力的方向。本论文针对现有hIV-1 rnase h抑制剂存在的缺点,基于hIV rnase h靶标的晶体结构和活性位点抑制剂的药效团模型,分别采用骨架跃迁策略和优势结构再定位策略对新型hIV rnase h抑制剂进行了两方面探索:一、基于骨架跃迁策略的二羟基香豆素类hIV-1 rnase h抑制剂的设计、合成及活性评价二羟基香豆素骨架已被证明结合在rnase h活性位点,与活性位点内两个参与催化功能的镁离子配位,从而发挥rnase h抑制活性。本课题组前期发现了一个二羟基香豆素衍生物,具有低微摩尔水平的rnase h抑制作用(rnase h IC50=12.3 μM)及细胞水平显著的抗hIV-1活性(EC50=3.94 μM)。这些研究表明,二羟基香豆素骨架是一类可用作开发hIV-1 rnase h抑制剂的优势骨架,有望通过结构优化以提高活性与成药性。此外,本课题组通过对多酚金属螯合骨架的探索发现了一个具有纳摩尔级抑酶活性的新型双翼多酚类hIV-1 rnase h抑制剂DF-36,其抑制rnase h的IC50值为0.067μM,遗憾的是,其在细胞水平没有显示hIV-1抑制活性。细胞渗透性实验结果表明,DF-36具有较差的细胞渗透性,因此,推测该类化合物是由于无法穿过磷脂双分子层而无细胞水平的抗病毒活性。用薛定谔membrane permeability模块对DF-36进行了透膜性预测,结果表明多酚螯合骨架是造成其透膜性较差的主要原因。基于以上分析,我们以DF-36为先导化合物,保留DF-36中的优势双翼取代基,将DF-36中对透膜性不利的多酚金属螯合骨架跃迁为二羟基香豆素优势金属螯合骨架,以期在保持优良靶标活性的同时改善其透膜性从而发挥抗病毒活性,设计合成了一系列共28个结构新颖的二羟基香豆素衍生物。我们采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对目标化合物进行hIV-1 rnase h抑制活性测试,结果表明大多数化合物在低微摩尔水平对rnase h具有抑制作用(IC50=3.7 μM～17.9μM),其中活性最好的化合物是1-4和1-27,它们抑制rnase h的IC50值分别为4.2 μM和3.7 μM,但均低于阳性对照β-thujaplicinol(IC50=1.98 μM)和先导化合物DF-36(IC50h-8-Oh螯合三联体)与两个二价金属阳离子(Mg2+)之间存在相互作用,7位羟基与保守his539残基的侧链之间形成氢键,使抑制剂稳定地定位在四个金属螯合残基(Asp443、Glu478、Asp498和Asp549)附近的位置,哌嗪环上的两个疏水取代基朝向不同的蛋白质-溶剂界面,从而有助于化合物螯合构型的稳定。接着,采用MTT法在MT-4细胞系中进行体外抗病毒活性测试,结果表明该系列仅有一个化合物1-1具有微弱的抗hIV-1活性,EC50值为117.32 μM。值得一提的是,该系

关键词： hIV-1 rnase h 抑制剂药物化学策略优势结构药效团模型

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基于新靶标的hBV抑制剂研究进展(2):rnase h及其他靶标

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药学学报 2020年第4期55卷 566-574页

作者：魏粉菊马悦俞霁贾海永刘新泳展鹏山东大学药学院药物化学研究所化学生物学教育部重点实验室山东济南250012 潍坊医学院药学院山东潍坊261053

乙型肝炎已成为影响我国人民身体健康和社会发展的重大疾病之一。乙肝发病率高,病程长,目前已上市的抗乙肝病毒小分子药物无法治愈乙肝,因此,研发安全高效的新型乙肝病毒抑制剂具有重要意义。本综述承接前文关于hBV衣壳蛋白抑制剂的研... 详细信息

乙型肝炎已成为影响我国人民身体健康和社会发展的重大疾病之一。乙肝发病率高,病程长,目前已上市的抗乙肝病毒小分子药物无法治愈乙肝,因此,研发安全高效的新型乙肝病毒抑制剂具有重要意义。本综述承接前文关于hBV衣壳蛋白抑制剂的研究进展,精选近几年具有代表性的研究实例,从药物化学的视角总结了抗乙肝病毒药物rnase h类及其他靶标抑制剂的前沿进展。

关键词：乙型肝炎药物靶标 rnase h 抑制剂药物设计

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基于优势骨架的新型hIV-1/hBV rnase h抑制剂的设计、合成及活性评价

基于优势骨架的新型HIV-1/HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性...

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作者：魏粉菊山东大学

学位级别：硕士

逆转录病毒包括人类免疫缺陷病毒1型和2型(分别为hIV-1和hIV-2)和乙肝病毒(hBV)在内的许多重要的人类病原体。其中,hIV-1、hBV分别是艾滋病(AIDS)和乙肝(ChB)的主要病原体。在全球范围内,艾滋病毒感染人数居高不下,其中,约有10%的hIV感... 详细信息

逆转录病毒包括人类免疫缺陷病毒1型和2型(分别为hIV-1和hIV-2)和乙肝病毒(hBV)在内的许多重要的人类病原体。其中,hIV-1、hBV分别是艾滋病(AIDS)和乙肝(ChB)的主要病原体。在全球范围内,艾滋病毒感染人数居高不下,其中,约有10%的hIV感染者并发感染hBV,严重威胁着人类的健康与生命。尽管高效抗逆转录病毒疗法(hAART)和核苷酸类似物疗法分别在控制hIV病毒载量、抑制hBV的增殖和降低肝脏相关并发症的发生等方面发挥了十分重要的作用,但是长期用药所产生的耐药性以及蓄积毒性限制了当前疗法的广泛应用,因此,研发具有新靶标、新机制的高效、低毒、抗耐药性的新型抗hIV/hBV药物显得尤为重要。hIV和hBV逆转录酶(RTs)由两种酶组成:DNA聚合酶和核糖核酸酶h(rnase h),它们在逆转录过程中以协调的方式促进双链病毒DNA的产生。其中,rnase h是核酸内切酶,在核心催化域内,hBV约有23%的氨基酸序列与hIV一致。rnase h通过切割RNA/DNA杂合双链中的RNA,促进病毒双链DNA的合成。尽管目前文献报道了多种rnase h活性抑制剂,但是,由于其中大多数存在细胞毒性大、抗病毒活性差等缺点,迄今为止该类抑制剂尚未被批准应用于临床,因此,开发特异性高、细胞毒性低、抗病毒活性强的新型rnase h抑制剂仍然是当前抗病毒药物研究的主要方向。基于hIV/hBV rnase h核心催化域的结构以及功能的相似性,本论文基于课题组前期发现的抗病毒优势骨架,分别采用“双翅膀”取代修饰、优势取代基杂合等策略对新型hIV/hBV rnase h抑制剂的研究进行了全面的探索。新型多酚类hIV-1 rnase h抑制剂的设计、合成与活性评价。自然界中的多酚类化合物种类数不胜数,分布广泛,具有抗氧化、抗肿瘤以及抗病毒等生物活性。本课题组早期通过探索发现了具有酶抑制活性的多酚类hIV-1 rnase h抑制剂11,但因其极性大、膜通透性差,导致其细胞水平的抗病毒活性弱。与此同时,hIV-1 rnase h活性位点的配体结合口袋较浅,因此靶向蛋白-溶剂开口区,通过引入延展性结构对先导化合物进行结构改造,形成新的“附着力”,是提高病毒抑制活性、改善理化性质的有效途径。基于此分析,我们以11为先导化合物,根据蛋白-溶剂开口区的结构特征,保留优势的金属螯合骨架,分别在哌嗪环的C2、C3位引入优势疏水侧链,形成“双翅膀”型取代基,使分子呈现“Y”型构象,同时对引入取代基的多样性进行探讨,设计合成了一系列共20个新型多酚类衍生物。抑酶活性结果显示,与阳性对照β-侧柏酚(IC50=1.98±0.22 μM)相比,11个目标化合物表现出更佳的抑制活性,其中,化合物IA-6抑制活性最佳,达到0.067±0.02 μM,约为β-侧柏酚的30倍。分子模拟表明,多酚金属螯合基团可与两个Mg2+形成关键的金属螯合作用,两条侧链分别朝向不同的蛋白-溶剂界面,稳定小分子与蛋白质的结合构象,其中,新引入的呋喃基甲胺基朝向h539,可与之形成额外的疏水作用。不幸的是,该类化合物未表现出细胞水平抗病毒活性,但是值得肯定的是,这一系列化合物中大部分具有很低的细胞毒性,优于对照拉米夫定(3TC)和奈韦拉平(NVP),具有进一步开发的潜力。新型羟基喹唑啉类hIV-1 rnase h抑制剂的设计、合成与活性评价。在新药研发的过程中,药物小分子结构的复杂性影响其与目标蛋白的亲和力,其中,Fsp3(sp3杂化碳原子的分数,即sp3杂化碳原子数/总碳数)通过确定分子的碳饱和度,表征分子空间结构的复杂性,对药物药效的提高发挥着十分重要的作用。通过提高Fsp3值,使其在三维空间上更舒展,占据更大的空间,是改善目标化合物理化性质的有效方法。本论文针对课题组早期发现的新型羟基喹唑啉类rnase h抑制剂所表现出的细胞渗透性差、抗病毒活性弱等缺点,以43为先导化合物,在保留羟基喹唑啉优势骨架的基础上,一方面,借鉴Fsp3概念,引入柔性的饱和杂环取代基,提高Fsp3值,改善理化性质;另一方面,借鉴优势疏水性取代基,对43进行系统的侧链修饰,丰富取代基的结构类型,设计合成了一系列共10个化合物。抑酶活性结果表明,6个化合物的活性较阳性对照β-thujaplicinol有了一定程度的提高,其中化合物Ⅱ-9和Ⅱ-10对于hIV-1 rnase h的抑制活性与先导化合物43相当,IC50值分别为0.99±0.30 μM和0.82±0.29μM。相关的体外抗hIV活性测试正在进行。新型吡啶骈嘧啶酮类hBV rnase h抑制剂的设计、合成及活性评价。药物再定位策略,又称“老药新用”,主要是发现已批准或正在研究的药物在原有药理作用范围外的新用途。与针对特定适应症开发的全新型药物相比,该策略

关键词： hIV-1 hBV rnase h 抑制剂优势骨架

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脱氧核酶生物传感技术在Pb2+和rnase h检测中的应用研究

脱氧核酶生物传感技术在Pb2+和RNase H检测中的应用研究

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作者：王兰博湖南大学

学位级别：硕士

DNAzyme(脱氧核酶)作为一种人工合成的序列自被发现以来,因其高效的催化活性和结构识别能力,已被逐渐开发应用于生物分子检测领域。本论文通过研究已报道过的DNAzyme,对其序列进行碱基替换,构建了Mg依赖性的DNAzyme,在此基础上,结合了... 详细信息

DNAzyme(脱氧核酶)作为一种人工合成的序列自被发现以来,因其高效的催化活性和结构识别能力,已被逐渐开发应用于生物分子检测领域。本论文通过研究已报道过的DNAzyme,对其序列进行碱基替换,构建了Mg依赖性的DNAzyme,在此基础上,结合了荧光分子信标,实现了体外对金属离子和蛋白酶的高灵敏度检测,并在复杂样本中也取得了成效,此外,还探讨了一些药物对DNAzyme催化效率的影响。本文的主要研究内容如下:1.基于DNAzyme和r GO实现对铅离子的超灵敏检测在该体系中,我们设计了一条含有RNA碱基的单链荧光探针,并利用rGO(还原性氧化石墨烯)对不同长度DNA链的吸附特性以及r GO的荧光淬灭能力,构建了一个对Pb的超灵敏检测体系。首先,我们在不同p h,温度和探针浓度下进行试验,选出了DNAzyme活性最高的条件。此外,为了提高检测限,我们选取荧光淬灭效率较高的r GO作为荧光淬灭平台,同时我们对其用量进行了优化并与普通GO产生的效果进行对比。结果发现:(a)要使荧光探针完全淬灭需要10μg/m L的GO,而使用r GO时只需要不到4μg/m L,且使用r GO时,不加入DNAzyme与加入DNAzyme的信号差值更大;(b)通过这种方法检测Pb的检测下限为100p M,具有非常优秀的灵敏性;(c)用此方法在血清中检测Pb,检测限可以达到500p M(0.1μg/L),低于人体内的正常血铅范围(rnase h活性检测及其在复杂样本中的应用该体系中,首先我们在已报道过的Pb依赖性的DNAzyme的序列上进行碱基的替换,成功使得该Pb依赖性的DNAzyme转变成Mg依赖性的DNAzyme,而且对Mg有着高度特异性。这种Mg依赖性的DNAzyme可以将我们设计的双标发夹型探针打开,我们将该DNAzyme序列嵌入一个发夹型的DNA-RNA嵌合链中以抑制其活性。接着,利用rnase h(核糖核酸酶h)切割DNA-RNA杂交链的特性将DNAzyme释放出来并恢复活性。通过这种活性“开关”建立了对rnase h活性检测体系。结果表明:(a)该体系对rnase h检测下限为0.01U/m L,并且在血清环境中及细胞提取液中均能进行检测;(b)研究了11种不同天然药物对rnase h的影响,结果发现这11种药物对rnase h均有激活作用,并具有浓度依赖性;(c)分析了6种抗生素对DNAzyme催化效率的影响,发现庆大霉素和硫磺链霉素对DNAzyme催化活性有一定的抑制作用;(d)该体系还可以对Mg和DNAzyme进行检测,其中,对Mg的检测下限为5n M,对DNAzyme的检测限为5p M。

关键词：分子信标 DNAzyme 金属离子 rnase h r GO

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基于靶标结构的新型hIV-1整合酶抑制剂与rnase h抑制剂的设计、合成及活性评价

基于靶标结构的新型HIV-1整合酶抑制剂与RNase H抑制剂的设计、合...

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作者：程锡强山东大学

学位级别：硕士

艾滋病严重威胁着人类的健康与生命,主要病原体为hIV-1。目前已有30个抗hIV-1化学实体药物获***批准上市,高效抗逆转录病毒疗法(hAART)的应用大大降低艾滋病的发病率和死亡率,然而该疗法的长期应用对病人造成了严重毒副作用及耐药性问... 详细信息

艾滋病严重威胁着人类的健康与生命,主要病原体为hIV-1。目前已有30个抗hIV-1化学实体药物获***批准上市,高效抗逆转录病毒疗法(hAART)的应用大大降低艾滋病的发病率和死亡率,然而该疗法的长期应用对病人造成了严重毒副作用及耐药性问题。因此,亟需开发高效、低毒、抗耐药或具有新靶点、新机制的新型抗hIV-1药物。hIV-1整合酶(Integrase,IN)是hIV-1生命周期中的必需酶,催化逆转录得到的病毒DNA整合进入宿主细胞DNA中。目前有四种hIV-1整合酶抑制剂经***批准上市,然而由于耐药株的相继出现,该类药物的疗效显著降低,研发新型高效且抗耐药整合酶抑制剂成为目前抗hIV-1药物研究的热点。hIV-1 rnase h在hIV-1逆转录过程中发挥重要作用,是抗hIV-1药物设计中非常有前景的新靶标。尽管发现了多种rnase h活性位点抑制剂,但其大多数存在抗病毒活性差、细胞毒性大等缺点,目前尚无该类抑制剂进入临床应用,因此迫切需要开发高特异性、具有细胞活性的新型hIV-1 rnase h抑制剂。hIV-1整合酶与rnase h作为金属蛋白(Metalloprotein),催化位点高度保守,是目前抗hIV-1药物研究领域中十分热门的两个靶标。然而,分子模拟研究的局限性等问题给基于金属蛋白结构进行合理药物设计带来了很大的挑战。基于优势结构的药物设计策略已成为药物发现的有效方法。鉴此,本论文基于靶标结构,并结合优势骨架进行了新型hIV-1整合酶抑制剂与rnase h抑制剂的探索。新型8-羟基-1,6-二氮杂萘类hIV-1整合酶抑制剂的设计、合成与活性评价。链转移抑制剂(INSTIs)金属螯合基序的对位有较大的可容纳空间,在该位置引入大基团占据该口袋可能会与整合酶产生额外的结合力,从而提高整合酶抑制活性,增加抗耐药性。8-羟基-1,6-二氮杂萘是INSTIs优势骨架,早期该类骨架的取代基修饰位点大多集中于金属螯合基序的“侧位”,而龙亚秋课题组发现的新型INSTIs 60证明了在金属螯合基序对位进行大体积基团修饰的可行性。本课题组发现的吡啶并嘧啶酮类高效INSTIs也有力验证了该设计思路的合理性。受此启发,本论文选取8-羟基-1,6-二氮杂萘为母环,在其螯合基序对位引入多样性的芳香性疏水结构,设计合成了一系列共20个新型的8-羟基-1,6-萘啶衍生物。酶活测试结果显示,四个目标化合物(1-4、1-6、1-7和1-20)表现出了较好的整合酶抑制活性,化合物I-6抑制活性最佳(IC50=1.46±0.13 μM),接近于RAL(IC50=0.77±0.33μM)。此外,所有化合物均无rnase h抑制活性(IC50>50 μ]M),因此属于选择性整合酶抑制剂。细胞活测试结果表明,两个目标化合物(1-11和1-18)表现微弱的抗hIV-1活性。细胞渗透性测试表明,该类化合物透膜性差,可能是影响其发挥抗hIV-1活性的重要因素之一。分子动力学模拟发现,该类化合物与整合酶Y212和Q186的强结合作用对其能高效选择性抑制hIV-1整合酶至关重要。总之,该系列化合物探索了金属螯合基序对位的可容纳区,丰富了整合酶抑制剂的构效关系,为发现新型高效的hIV-1整合酶抑制剂奠定了基础。新型吡啶并嘧啶酮类hIV-1 rnase h抑制剂的设计、合成与活性评价。rnase h配体结构口袋有尚未开发的结合位点,选取具有金属离子螯合能力的优势骨架,开展系统性的侧链修饰,以充分占据蛋白溶剂界面的关键氨基酸残基,是发现新型高效hIV-1 rnase h抑制剂的有效途径。王正强教授课题组选取早期发现的hIV-1 rnase h抑制剂为先导化合物,采用基团添加策略,发现了新型高效的“双翅膀型”rnase h抑制剂。受此启发,我们选取了本课题组早期发现的具有细胞活性的吡啶并嘧啶酮类hIV-1整合酶抑制剂(30)为先导化合物,在其母环的C4、C6位引入rnase h抑制剂的优势疏水侧链,以期提高其与rnase h结合力,降低化合物的极性,提高其膜通透性,设计合成了一系列共14个新型的吡啶并嘧啶酮衍生物。rnase h抑制测试结果显示,七个目标化合物的抑制活性超过阳性对照β-thujaplicinol(IC50=1.98±0.22μμM),化合物II-9抑制活性最佳,达到0.54±0.27μM。分子模拟发现,该类化合物的左翼与rnase h S499、Y501形成了双重氢键作用,而右翼与N474形成了强疏水相互作用,可能是其能高效抑制hIV-1 rnase h的关键。总之,该系列化合物为后续rnase h抑制剂的优化提供了参考。此外,目前整合酶活性抑制测试和体外抗hIV活性测试还在进行中。

关键词： hIV-1 整合酶 rnase h 抑制剂优势结构

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rnase h介导的反义寡聚脱氧核苷酸的翻译抑制——主链修饰提高特异性

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医学分子生物学杂志 1993年第5期 246-246页

作者：文立民

有许多研究显示rnaseh参与了反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)抑制靶基因翻译的过程,它能降解互补的RNA/DNA双链中的RNA。非修饰的15聚体ODN1与免α球蛋白mRNA(α-mRNA)完全互补,与β球蛋白mRNA(β-mRNA)至少有60％的部分互补。由ODN1经过两端... 详细信息

有许多研究显示rnaseh参与了反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)抑制靶基因翻译的过程,它能降解互补的RNA/DNA双链中的RNA。非修饰的15聚体ODN1与免α球蛋白mRNA(α-mRNA)完全互补,与β球蛋白mRNA(β-mRNA)至少有60％的部分互补。由ODN1经过两端不同程度的甲基化分别形成ODN2和ODN3两种三明治式的寡聚物(MPSO),它们中间非修饰的脱氧核苷酸分别为5个和7个。作者将α、β-mRNA分别与ODN1、ODN2和ODN3加到富含rnaseh的体外翻译系统麦胚提取物中培养,然后PAGE电泳和放射性自显影。结果,0.3～0.5μmol/L ODNI

关键词： MPSO mRNA ODN 反义甲基化烷基化 rnase h 特异性

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基于DNA纳米机器的核糖核酸酶h的灵敏检测

基于DNA纳米机器的核糖核酸酶H的灵敏检测

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中国化学会第十三届全国分析化学年会

作者：舒明波王文静华中农业大学

rnaseh,即Ribonucleaseh,中文名为核糖核酸酶h,是一类特异性地水解RNA/DNA杂交双链中RNA的核酸内切酶。它在DNA损伤修复、基因复制、转录及其他生物学过程中扮演着十分重要的角色。同时,其在许多反转录病毒的反转录过程中发挥重要作用,... 详细信息

rnaseh,即Ribonucleaseh,中文名为核糖核酸酶h,是一类特异性地水解RNA/DNA杂交双链中RNA的核酸内切酶。它在DNA损伤修复、基因复制、转录及其他生物学过程中扮演着十分重要的角色。同时,其在许多反转录病毒的反转录过程中发挥重要作用,hIV逆转录病毒的复制过程也极大的依赖rnase h,所以,发展能够快速灵敏检测rnase h活性的方法就显得尤为重要[1]。本文中,我们开发了DNA纳米机器作为信号放大手段的rnase h灵敏检测方法。将活性被封闭的DNA酶链修饰于13nm金上做为信标探针,当存在rnase h的情况下,溶液中RNA/DNA杂交链中RNA被切割,将DNA链释放出来,释放的DNA可以将被封闭的DNA酶激活,在金属离子作用下切割底物链,将荧光基团FAM释放,荧光得到恢复,进而对于rnaseh的活性进行定量测定。由于DNA酶链可以重复利用,因而可以像机器一样将修饰在金上的底物链完全切割,发挥信号放大的作用。本方法简单灵敏,并可用于快速筛选rnase h抑制剂。

关键词： rnase h DNA纳米机器信号放大荧光检测抑制剂

来源： cnki会议评论

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氧化石墨烯荧光探针用于核酸酶的热动力学分析和药物筛选

氧化石墨烯荧光探针用于核酸酶的热动力学分析和药物筛选

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作者：彭兰湖南大学

学位级别：硕士

生物分子的快速检测是现代生物医学和分析化学领域的重要研究课题之一。与一些成本高,实验过程冗杂的传统生物技术相比,荧光分子探针技术是一种成本低廉、灵敏度高、特异性强,操作简单的研究手段。它能将检测的复杂生物分子信息转变为... 详细信息

生物分子的快速检测是现代生物医学和分析化学领域的重要研究课题之一。与一些成本高,实验过程冗杂的传统生物技术相比,荧光分子探针技术是一种成本低廉、灵敏度高、特异性强,操作简单的研究手段。它能将检测的复杂生物分子信息转变为易于检测的荧光信号,因此被广泛地应用于各种生物分子如蛋白质、核酸、酶等的快速检测中。然而,现有的荧光探针技术在应用中存在一些缺陷：如荧光体系的背景信号高、所用材料的生物相容性差、实验结果欠稳定等。因此进一步改进和发展新型荧光分子探针技术具有极其重要的应用价值。近年来,科学家们发现氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作为一种通用荧光淬灭剂具有吸附单链核酸的能力,此外,吸附于GO表面的功能核酸分子具有较高的细胞转染效率、低细胞毒性以及较强的生物稳定性。因此,GO结合荧光分子探针技术可以降低背景信号、改善生物相容性、提高灵敏度等,从而被广泛应用于细胞内特定基因及代谢物的检测和成像等生命活动。本文将GO与核酸酶本身固有的生物学特性相结合,利用氧化石墨烯荧光探针技术开展了一系列快速,简单,高特异性的核酸酶活性与动力学分析以及抑制剂的体内外筛选研究。本文的主要研究内容如下：1.基于氧化石墨烯荧光技术用于绿豆核酸酶热动力分析和抑制剂的筛选基于绿豆核酸酶诱导单链DNA断裂以及氧化石墨烯对不同长度的单链DNA亲和力不同而设计了基于荧光探针技术对绿豆核酸酶的定量定性分析实验。在通优化的酶促反应条件下,绿豆核酸酶线性检测范围为2×10-4-4×10-2unit/mL,检测下限为1×10-4 unit/mL,最适GO浓度为15μg/ml,体系的最适酶反应浓度为8×10-2unit/mL,在37℃下反应30min最为合适。该方法进一步用于考察不同抗生素和重金属离子对酶活力的影响。其检测结果得到了琼脂糖凝胶电泳法的验证。这种灵敏度高的检测方法适合绿豆核酸酶体内、外的定量定性分析。有趣的是,我们发现：抑制绿豆体内核酸酶活性可导致抑制绿豆芽的生长。2.基于氧化石墨烯荧光技术对脱氧核酸酶Ⅰ ( DNase Ⅰ)的活性分析DNase Ⅰ是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡核苷酸,本章利用氧化石墨烯这种通用淬灭剂对不同长度DNA亲和力不同的特点以及荧光分子探针技术选择性高,灵敏度高,操作简易的优点来开展DNase Ⅰ的热动力分析以及体内外抑制剂的筛选。本文从多种不同的单链或双链荧光分子探针中筛选得到了信背比最高的探针,进一步将其用于DNase Ⅰ的定量分析。在优化检测条件下,得到DNase I酶浓度的范围为1×104到6×10-2unit/mL,检测下限为0.5×10-4unit/mL。开展进一步研究DNA酶Ⅰ活性抑制剂筛选结果发现：庆大霉素和卡那霉素具有抑制DNA酶Ⅰ活性的能力,红霉素为激活剂;AS3+、Pb2+、Cu2+、 hg2+、Cd2+能抑制酶活性,而Mg2+和Mn2+作用效果相反。该方法还被用于肿瘤和血清中的DNA酶Ⅰ定量定性检测,结果表明：该方法可用于1 μg总蛋白中的DNase Ⅰ活性检测。***-嵌合核酸荧光探针用于rnase h活性分析方法的建立及其应用本章以DNA-RNA异源双链核酸探针作为酶促底物和信号报告分子,结合氧化石墨烯猝灭荧光的能力建立一种rnase h活性分析方法,将其用于rnase h的热动力学考察以及rnase h的抑制剂筛选。结果表明这种rnase h活性检测线性区间为1.0×10-4-4.0×10-2unit/mL,检测下限可以达到0.5×10-4 unit/mL;抑制剂筛选结果发现庆大霉素、链霉素以及hg2+等重金属离子均能显著抑制rnase h活性。最后将该方法用于微量复杂生物样品中的rnase h表达水平分析。

关键词： GO 荧光探针 MBN DNase I rnase h 胃癌

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基于还原型氧化石墨烯荧光探针的核糖核酸酶检测分析

基于还原型氧化石墨烯荧光探针的核糖核酸酶检测分析

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作者：赵传湖南大学

学位级别：硕士

核糖核酸酶A(rnase A)是一种广泛应用于酶学、生物化学、结构生物学等领域研究的工具酶,同时,这种具有有效杀伤肿瘤细胞和抑制hIV-1病毒复制能力的核酸酶可直接作为多种疾病的治疗药物;核糖核酸酶h(rnase h)是一种特异性切割RNA/DNA双... 详细信息

核糖核酸酶A(rnase A)是一种广泛应用于酶学、生物化学、结构生物学等领域研究的工具酶,同时,这种具有有效杀伤肿瘤细胞和抑制hIV-1病毒复制能力的核酸酶可直接作为多种疾病的治疗药物;核糖核酸酶h(rnase h)是一种特异性切割RNA/DNA双链中的核糖核苷酸的核酸内切酶,在调节免疫防御过程及维持真核生物基因组稳定方面具有重要意义。因此,开展两种相关性核酸酶的活性监测不仅能对酶动力学进行分析而且能对酶与疾病之间的关系进行揭示。本论文基于还原型氧化石墨烯(rGO)尺寸小、分散性好、猝灭能力强这些优点,开展了简单、特异、灵敏的核糖核酸酶检测体系构建及其应用研究。主要内容如下:1.基于rGO荧光纳米探针的rnase A酶活性分析方法建立和应用。首先,我们基于rGO和荧光探针构建了一个rnase A活性检测平台。结果表明:该体系的最适还原型氧化石墨烯浓度为8μg/mL,最适反应温度与时间分别为37℃和35 min。体系中rnase A活性的检测下限为0.05 pg/μL。为了验证该方法在实际中的应用性,我们利用该方法考察了不同价态的重金属离子对rnase A活性影响。结果表明:重金属离子Ba、Co、Pb、As、Cu对rnase A活性的抑制效果均成浓度依赖性且其IC分别为93.7μM(Ba),90.9μM(Co),110.6μM(Pb),171.5μM(As)and 165.1μM(Cu)。之后,结合体内外实验考察药用植物天然提取成分与rnase A之间的相互关系进行研究,发现一定浓度范围内,所有的小分子药物呈浓度依赖性激活rnase A活性。细胞内实验表明rnase A活性水平在SMMC-7721细胞中是MCF-7细胞中的1.5倍;G-10和Chikusetsusaponin V处理诱导MCF-7和BEL7404细胞中rnase A活性升高,对SMMC-7721细胞中rnase A活性影响不大。最后,我们将新方法用于正常人与hBV患者血清样品中rnase A活性水平比较,结果表明hBV感染能导致血清中的rnase A活性降低。以上结果表明:本章建立的新方法不仅能用于rnase A活性监测和效应药物筛选体内外快速、高通量筛选,而且还能用于与rnase A活性变化相关的疾病早期诊断。2.基于rGO-DNAzyme猝灭荧光探针构建荧光循环放大法检测rnase h及其天然抑制剂筛选。首先,我们基于荧光探针、rGO和DNAzyme发展了一个rnase h活性检测方法。结果表明:该体系的最适还原型氧化石墨烯浓度为4μg/mL,酶最适反应温度与时间分别为37℃和40 min。理想条件下这种新的rnase h活性分析方法的检测下限为0.01 U/mL。天然药物体外筛选实验表明:考察的16种天然药物中对rnase h活性具激活和抑制作用的分别为4种和5种。其中,5种具抑制作用的天然药物对rnase h活性抑制呈浓度依赖性。此外,该方法还被用于不同肿瘤细胞的rnase h活性监测,实验表明:rnase h水平在MCF-7,hela及hEPG-2细胞中具有差异性,MCF-7和hela细胞中的rnase h水平为hEPG-2细胞中的1.7倍。进一步考察A、L6、Y7 3种具有抑制作用的天然药物对细胞内rnase h活性影响,结果发现天然药物(A、L6、Y7)对三种肿瘤细胞(MCF-7,hela及hEPG-2)中rnase h活性差异性地抑制。其中,L6对rnase h活性影响最大,其对MCF-7,hela及hEPG-2细胞中rnase h活性抑制率分别为72.05%,68.66%和56.22%。A对MCF-7,hela及hEPG-2细胞中rnase h活性抑制率分别为56.02%,56.96%和43.05%。Y7对rnase h活性的影响最小,其对MCF-7,hela及hEPG-2细胞中rnase h活性抑制率分别为24.71%,24.19%和17.14%。血清实验结果表明:与正常组相比,rnase h活性在hCV病人血清中显著降低。以上结果表明:这种灵敏度高、成本较低的rnase h检测方法在活性检测、药物筛选及其相关功能评估等领域具有广泛的前景。

关键词： rGO 荧光探针 rnase A rnase h 天然药物 hBV hCV

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抗白血病寡核苷酸的筛查及其作用机理初探

抗白血病寡核苷酸的筛查及其作用机理初探

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作者：梁敬平广西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过筛查39条随机设计的寡核苷酸(OGN),从中发现一些具有抗hL-60细胞增殖的OGN,并初步探讨其作用机理,为今后应用OGN治疗AML提供更多的理论和实验依据。方法:1.随机设计并合成39条8-11nt长的OGN;2.设本底对照组、空白对照组、脂质... 详细信息

目的:通过筛查39条随机设计的寡核苷酸(OGN),从中发现一些具有抗hL-60细胞增殖的OGN,并初步探讨其作用机理,为今后应用OGN治疗AML提供更多的理论和实验依据。方法:1.随机设计并合成39条8-11nt长的OGN;2.设本底对照组、空白对照组、脂质体对照组和各OGN处理组。OGN处理组以脂质体Oligofectamine为载体将39条OGN分别转入hL-60细胞中;3.用CCK-8方法检测OGN对hL-60细胞增殖的影响;4.用倒置相差显微镜观察OGN处理后hL-60细胞的生长状态并拍照;5.用TRIZOL提取受OGN抑制的hL-60细胞的总RNA,送华大基因武汉分部做转录组测序(RNA-seq),筛查与脂质体对照组相比差异表达的基因,并用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法对转录组测序的某些结果进行技术验证。结果:1.C7G1、T4A4、A5C5和C5A5处理组的细胞生长抑制率(%)分别为:65.71±8.33、66.11±5.18、66.99±12.16和65.57±11.19,均比脂质体对照组高出20%,差异有统计学意义(PhL-60细胞具有抑制作用。(G3A)2G3处理组的细胞生长抑制率(%)为8.14±4.43,比脂质体对照组低30%左右,差异有统计学意义(PhL-60细胞具有保护作用;2.C7G1和T4A4对hL-60细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性,当终浓度为500nmol/L、作用时间为72h时,C7G1和T4A4对hL-60细胞的生长抑制率(%)最高,分别达到71.64±3.24和79.97±5.92;***对hL-60细胞也有抑制作用,抑制率在20%～50%之间,与空白对照组相比,差异有统计学意义(PhMP3、DUSP1、FOSB和IL17RB表达下调,TMEM189-UBE2V1表达上调,与转录组测序结果一致。C7G1处理组中RNF103-ChMP3和JMJD7-PLA2G4B表达下调,TMEM189-UBE2V1表达上调,与转录组测序结果一致。结论:1.C7G1、T4A4、A5C5和C5A5对hL-60细胞具有抑制作用,其中C7G1和T4A4对hL-60的抑制具有剂量和时间依赖性;2.(G3A)2G3对hL-60细胞具有保护的作用;3.T4A4可能通过下调RNF103-ChMP3、DUSP1、FOSB和IL17RB等基因的表达和上调TMEM189-UBE2V1基因的表达而抑制hL-60细胞的增殖;4.C7G1可能通过下调RNF103-ChMP3和JMJD7-PLA2G4B基因的表达和上调TMEM189-UBE2V1基因的表达而抑制hL-60细胞的增殖;***103-ChMP3和TMEM189-UBE2V1基因是T4A4和C7G1的共同作用靶点,提示T4A4和C7G1的抗AML作用可能具有相同的基因调控途径。

关键词：急性髓系白血病寡核苷酸 hL-60细胞 rnase h RNAi

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