基于靶标结构的新型HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价

作     者：张丽娜 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：展鹏

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：HIV-1 RNase H 抑制剂 药物化学策略 优势结构 药效团模型 

摘      要：艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染引起的获得性免疫缺陷综合征,严重危害人类生命健康。临床上对艾滋病的治疗主要依赖于“高效抗逆转录病毒疗法(HAART)。HAART可以有效地抑制病毒的复制,极大地降低感染者的发病率和死亡率。但目前的联合抗病毒疗法不能治愈艾滋病,且终身服药会引起严重的毒副作用和耐药病毒株的产生,从而限制了现有药物的疗效。因此,迫切需要开发新型的抗HIV-1药物,尤其是作用于新靶点或具有新机制的药物,为现有的HAART提供更多的配伍选择,这对于克服现有药物的耐药性具有重要的意义。HIV-1逆转录酶(RT)是HIV-1生命周期中的关键酶,负责将病毒单链RNA逆转录为病毒双链DNA。RT包含两个不同的结构域:DNA聚合酶结构域(具有RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性)和核糖核酸酶H(RNase H)结构域(参与逆转录过程中形成的RNA/DNA异源杂合双链中RNA模板的水解)。目前,所有已批准上市的抑制RT的抗HIV药物,包括核苷(酸)类逆转录酶抑制剂(N(t)RTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs),都只针对RT的DNA聚合酶活性,而尚无针对RNase H功能的抑制剂进入临床阶段。鉴于RNase H在HIV-1生命周期中发挥着关键作用,开发RNase H抑制剂具有重要的科学意义。根据作用机制的不同,目前公开报道的RNase H抑制剂可分为活性位点抑制剂和变构抑制剂,其中对活性位点抑制剂的研究较为广泛,是RNase H抑制剂研发的重点。然而,大多数活性位点抑制剂由于其结构特点而存在诸如选择性差、细胞毒性大、透膜性差和抗病毒活性弱等缺点,从而止步于临床研究阶段。因此,针对RNase H靶标开发高活性及成药性的抗艾滋病药物仍然是科研工作者需要努力的方向。本论文针对现有HIV-1 RNase H抑制剂存在的缺点,基于HIV RNase H靶标的晶体结构和活性位点抑制剂的药效团模型,分别采用骨架跃迁策略和优势结构再定位策略对新型HIV RNase H抑制剂进行了两方面探索:一、基于骨架跃迁策略的二羟基香豆素类HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价二羟基香豆素骨架已被证明结合在RNase H活性位点,与活性位点内两个参与催化功能的镁离子配位,从而发挥RNase H抑制活性。本课题组前期发现了一个二羟基香豆素衍生物,具有低微摩尔水平的RNase H抑制作用(RNase H IC50=12.3 μM)及细胞水平显著的抗HIV-1活性(EC50=3.94 μM)。这些研究表明,二羟基香豆素骨架是一类可用作开发HIV-1 RNase H抑制剂的优势骨架,有望通过结构优化以提高活性与成药性。此外,本课题组通过对多酚金属螯合骨架的探索发现了一个具有纳摩尔级抑酶活性的新型双翼多酚类HIV-1 RNase H抑制剂DF-36,其抑制RNase H的IC50值为0.067μM,遗憾的是,其在细胞水平没有显示HIV-1抑制活性。细胞渗透性实验结果表明,DF-36具有较差的细胞渗透性,因此,推测该类化合物是由于无法穿过磷脂双分子层而无细胞水平的抗病毒活性。用薛定谔membrane permeability模块对DF-36进行了透膜性预测,结果表明多酚螯合骨架是造成其透膜性较差的主要原因。基于以上分析,我们以DF-36为先导化合物,保留DF-36中的优势双翼取代基,将DF-36中对透膜性不利的多酚金属螯合骨架跃迁为二羟基香豆素优势金属螯合骨架,以期在保持优良靶标活性的同时改善其透膜性从而发挥抗病毒活性,设计合成了一系列共28个结构新颖的二羟基香豆素衍生物。我们采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对目标化合物进行HIV-1 RNase H抑制活性测试,结果表明大多数化合物在低微摩尔水平对RNase H具有抑制作用(IC50=3.7 μM～17.9μM),其中活性最好的化合物是1-4和1-27,它们抑制RNase H的IC50值分别为4.2 μM和3.7 μM,但均低于阳性对照β-thujaplicinol(IC50=1.98 μM)和先导化合物DF-36(IC500.5 μM)。分子模拟表明,二羟基香豆素螯合核心(即1-0-7-OH-8-OH螯合三联体)与两个二价金属阳离子(Mg2+)之间存在相互作用,7位羟基与保守His539残基的侧链之间形成氢键,使抑制剂稳定地定位在四个金属螯合残基(Asp443、Glu478、Asp498和Asp549)附近的位置,哌嗪环上的两个疏水取代基朝向不同的蛋白质-溶剂界面,从而有助于化合物螯合构型的稳定。接着,采用MTT法在MT-4细胞系中进行体外抗病毒活性测试,结果表明该系列仅有一个化合物1-1具有微弱的抗HIV-1活性,EC50值为117.32 μM。值得一提的是,该系