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水稻转录因子OsMYB14干涉载体构建、遗传转化与功能分析

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应用与环境生物学报 2013年第6期19卷 960-968页

作者：苗雁文李嵘熊方杰曾正明牛向丽刘永胜重庆大学生命科学学院重庆400000 合肥工业大学生物与食品工程学院合肥230009

MYB转录因子在植物生长发育和抗逆反应中发挥着重要的调节作用.分离了一个水稻R2R3-MYB基因OsMYB14,在盐、干旱和280-320 nm紫外线(UV-B)等非生物胁迫下,该基因表达量下调.利用RNA干涉技术构建OsMYB14的rnai干涉载体,通过农杆菌介导法... 详细信息

MYB转录因子在植物生长发育和抗逆反应中发挥着重要的调节作用.分离了一个水稻R2R3-MYB基因OsMYB14,在盐、干旱和280-320 nm紫外线(UV-B)等非生物胁迫下,该基因表达量下调.利用RNA干涉技术构建OsMYB14的rnai干涉载体,通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种日本晴,遗传转化获得转基因植株.Real-time PCR结果显示,转基因株系中OsMYB14基因的表达量显著降低.田间表型分析显示,与野生型日本晴相比,转基因株系的有效穗数和分蘖数明显增多.正常条件下,转基因株系和野生型株系幼苗的生长发育情况没有明显区别,但是转基因株系幼苗对盐、干旱和UV-B的耐受性显著增强,且对脱落酸(ABA)的敏感程度降低.这些结果说明,OsMYB14编码一个ABA依赖的,参与水稻生长发育和抗逆反应的MYB转录因子,在盐、干旱和UV-B等非生物胁迫的反应中起着调节作用.

关键词：水稻 MYB转录因子 rnai干涉非生物胁迫分蘖

水稻锌指蛋白基因OsBBX22响应热胁迫的功能分析

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基因组学与应用生物学 2018年第2期37卷 836-844页

作者：骆鹰谢旻张超王伟平朱建华万向元汪启明饶力群湖南农业大学生物科学技术学院长沙410128 湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室永州425199 杂交水稻国家重点实验室、湖南杂交水稻研究中心长沙410125 北京首佳利华科技有限公司、现代生物农业产业技术研究院北京100192

利用RNA干涉技术研究水稻锌指蛋白基因OsBBX22的生物学功能,为探讨OsBBX22响应热胁迫的机制、培育抗逆水稻、减轻高温对水稻的损害奠定基础。通过观察转基因突变体植株和野生型植株在热胁迫下的表型差异,分析OsBBX22生物学功能;采用半定... 详细信息

利用RNA干涉技术研究水稻锌指蛋白基因OsBBX22的生物学功能,为探讨OsBBX22响应热胁迫的机制、培育抗逆水稻、减轻高温对水稻的损害奠定基础。通过观察转基因突变体植株和野生型植株在热胁迫下的表型差异,分析OsBBX22生物学功能;采用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsBBX22以及相关的热激转录因子（HSF）、热激蛋白（HSP）基因在转基因突变体株系中的表达水平;通过原位组织化学检测过氧化氢在野生型、转基因突变体株系叶片中的定位和积累情况。结果表明,在0-5 h热胁迫条件下,与野生型株系相比,OsBBX22的表达在转基因突变体植株中明显下调;而野生型OsBBX22受热信号诱导,随着热激时间的增加,OsBBX22的表达量呈先上升后下降的趋势,且在热激1 h时表达量最高。相关的HSF和HSP也受热信号诱导,野生型株系中的HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100表达量均比转基因突变体株系高,且在热激1 h时,HSFA2a、HSP16.9和HSP100表达量最高,而HSFA7在热激3 h时表达最高。热胁迫3 h,经DAB染色,转基因突变体株系叶片上出现的红褐色斑点主要集中于叶脉和受损伤部位,且明显多于野生型。锌指蛋白基因OsBBX22在水稻苗期热胁迫应答中具有重要的作用,野生型株系抗热能力明显高于OsBBX22抑制表达转基因株系;HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100可能参与了OsBBX22介导的水稻耐热调控。

关键词：水稻锌指蛋白热胁迫 rnai干涉热激转录因子热激蛋白

陆地棉(Gossypium hirsutum)光敏色素B基因(GhPHYB)克隆及其生物信息学分析

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分子植物育种 2015年第8期13卷 1725-1729页

作者：李建平郝晓燕陈勋基陈果罗城刘海峰黄全生中国彩棉(集团)股份有限公司乌鲁木齐830023 新疆农业科学院核技术生物技术研究所乌鲁木齐830091

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥... 详细信息

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥光敏色素B氨基酸序列比对及蛋白结构预测,发现该基因包含植物光敏色素完整的结构,与烟草、拟南芥、水稻、小麦和玉米的氨基酸序列相似性分别为87.2%、77.9%、74.5%、74.5%和54.6%。同时,本研究还构建了Gh PHYB基因的rnai干涉载体用于转化棉花,并通过构建棉花PHYB rnai突变体了解陆地棉PHYB基因对棉花株型、开花期、产量、棉纤维品质、抗逆性等方面的调控作用。研究结果可为该基因今后应用于棉花生产奠定基础。

关键词：陆地棉光敏色素B 克隆 rnai干涉

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外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒干扰调控研究

外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒干扰调控研究

作者：张姣安徽农业大学

学位级别：硕士

玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使... 详细信息

玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术对玉米进行遗传改良，以增强玉米抗病虫与耐逆境能力，提高产量，改善品质，这成为玉米遗传育种的一个新方向。植物抗病毒基因工程的策略有多种，研究表明利用rnai原理介导的抗病性特异性强，比较容易获得高抗甚至免疫的转基因植株，为作物抗病毒基因工程提供了更有效的途径。本文利用RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因特异性干涉片段，构建原核表达载体LMCP，利用IPTG诱导表达，并对诱导条件进行优化，利用细菌表达的dsRNA提取液处理玉米植株，分析外源dsRNA抗SCMV的效果。结果表明： 1、根据甘蔗花叶病毒cp基因序列设计特异性引物，RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因上游及下游147bp和140bp的干涉片段。 2、利用pUCCrnai克隆载体构建甘蔗花叶病毒cp基因反向重复序列克隆载体pUCCrnai+2F，再插入到原核表达载体L4440中，构建原核表达载体LMCP，转化大肠杆菌HT115。 3、利用IPTG诱导并对诱导条件进行优化，结果表明，LMCP在大肠杆菌HT115（DE3）菌株中可表达产生预期大小的dsRNA片段。而且当IPTG浓度为0.4~0.6mmol/L，诱导4h左右时表达量最高。 4、利用不同细菌表达的dsRNA提取液喷洒4叶期玉米植株，结果发现，LMCP1dsRNA及LMCP2dsRNA对甘蔗花叶病毒的干涉效果明显，而且LMCP1dsRNA的处理效果较LMCP2的好。 5、通过对dsRNA的处理浓度、接种病毒的时间（持效期）、渗透性等参数进行优化。结果表明，外源dsRNA提取液对甘蔗花叶病毒具有免疫作用，当dsRNA稀释1/5以内时，对病毒侵染的干涉作用明显，当超过1/15时，处理效果大大下降。dsRNA喷洒后3d之内接种病毒，抗病效果明显，超过7d则不明显。另外，添加一定浓度的渗透剂有利于提高外源dsRNA的抗病效果。综上所述，本实验成功构建了表达载体LMCP，优化了诱导表达条件，并且建立了外源dsRNA调控甘蔗花叶病毒的技术体系，为玉米及其它植物病毒病的防治提供了依据。

关键词：甘蔗花叶病毒 rnai干涉 dsRNA IPTG诱导

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菊花CmMET1基因沉默后的遗传效应分析

菊花CmMET1基因沉默后的遗传效应分析

作者：李飞河南大学

学位级别：硕士

本课题组前期已将菊花DNA甲基化维持基因CmMET1的rnai干涉载体以农杆菌介导的方法转化菊花品种“紫精灵”愈伤组织并获得分化苗,发现转基因植株CmMET1基因表达量降低。本研究以此转基因苗为基础,移栽至实验田,分析记录植株株高、叶形、... 详细信息

本课题组前期已将菊花DNA甲基化维持基因CmMET1的rnai干涉载体以农杆菌介导的方法转化菊花品种“紫精灵”愈伤组织并获得分化苗,发现转基因植株CmMET1基因表达量降低。本研究以此转基因苗为基础,移栽至实验田,分析记录植株株高、叶形、成花时间等表型变化。利用实时荧光定量PCR技术检测CmMET1基因表达量降低的转基因植株内其它甲基转移酶表达量变化,利用甲基敏感性扩增多态性(MSAP)及高效液相(HPLC)检测甲基转移酶CmMET1基因的表达量降低对转基因植株的DNA甲基化水平的影响。选用菊花早花品种“国庆红”和晚花品种“洹水金秋”(非转化菊花品种)为接穗分别嫁接至转基因紫精灵(处理组)与非基因紫精灵(对照组)上研究rnai沉默信号在菊花不同品种之间的传递效果。主要研究结果如下:(1)rnai干涉CmMET1基因对菊花砧木及接穗CmMET1基因表达的影响:直接用含rnai-CmMET1载体的农杆苗浸染紫精灵愈伤组织分化出的转基因植株CmMET1相对表达量为非转基因植株的46.51%,嫁接到转基因紫精灵上的菊花品种国庆红、洹水金秋的CmMET1基因相对表达量分别为其嫁接到非转基因紫精灵上的58.67%、52.5%,3个菊花栽培品种的CmMET1基因相对表达量与对照组的相比差异极显著(0.01水平)。rnai沉默信号可以通过嫁接部位向接穗传递,但在菊花不同品种之间干涉效果稍有不同,可能是因为不同品种之间靶点区存在序列差异性导致。(2)rnai干涉CmMET1基因对菊花砧木及接穗表型的影响:转基因植株茎节变短,植株矮小,有早熟的趋势。叶片缺刻变浅,顶端叶子颜色黄化,叶面有黄色斑点,黄色斑点在生长至开花期可自行恢复。砧木及接穗晚花品种洹水金秋现蕾时间和初花时间与对照相比分别提前10 d和8 d、12 d和9 d,花蕾发育时间处理组与对照间没有差异。接穗早花品种“国庆红”处理组与对照组之间几乎同时现蕾,处理组花蕾发育时间缩短14 d。(3)rnai干涉CmMET1基因对菊花砧木及接穗其它甲基转移酶表达量的影响:菊花品种紫精灵、国庆红、洹水金秋CmMET1表达量降低引起植株甲基转移酶CmDRM2基因表达分别上调31%、29%、21%。去甲基转移酶CmDME在菊花不同品种之间呈现下降的趋势:转基因紫精灵植株CmDME相对表达量是非转基因的73.58%,嫁接到紫精灵转基因上的菊花品种国庆红、洹水金秋的CmDME相对表达量分别为其嫁接到非转基因紫精灵上的85.01%、68.74%。(4)rnai干涉CmMET1基因对菊花砧木及接穗中的DNA甲基化水平的影响:砧木及接穗与对照相比全基因组范围内的DNA甲基化率分别降低14.88%、11.2%、13.84%(HPLC)。砧木及接穗与对照相比CG位点DNA甲基化率分别降低12.6%。8.9%、13%,除菊花品种国庆红外,CG位点甲基化模式发生了改变(MSAP)。转座子上CG位点的DNA甲基化率也呈现下降的趋势(iPBS-MSAP)。由下降程度可知:CmMET1基因活性降低主要影响CG位点的甲基化率。(5)菊花砧木及接穗中基因组甲基化水平降低对其开花基因FT-likes表达量的影响:在菊花中含有三个FT-likes基因家族,其中FTL1表达下调,FTL2、FTL3整体呈现上调的趋势。

关键词： rnai干涉菊花嫁接基因表达成花 DNA甲基化

大丽轮枝菌病程相关基因的筛选及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探

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大丽轮枝菌病程相关基因的筛选及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探

作者：齐希梁中国农业科学院

学位级别：硕士

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是一种真菌病害，能侵染棉花，对棉花生产造成非常大的危害。利用rnai技术对大丽轮枝菌（V. dahliae）病程相关基因的干涉对防治棉花黄萎病（Verticillium Wilt）提供了一条新的思路。同时研究抗病... 详细信息

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是一种真菌病害，能侵染棉花，对棉花生产造成非常大的危害。利用rnai技术对大丽轮枝菌（V. dahliae）病程相关基因的干涉对防治棉花黄萎病（Verticillium Wilt）提供了一条新的思路。同时研究抗病防卫机制的信号通路，挖掘植株自身未知功能基因的潜力，利用植物自身基因资源来防治黄萎病菌的危害，整体提高植株抗病性，为培育高抗黄萎病新品种提供了新的途径。因此，本研究主要分为两部分：大丽轮枝菌（V. dahliae）病程相关基因的筛选和抗病相关基因GbEDS1的克隆与功能初步探索，取得以下研究结果： 1.大丽轮枝菌（V. dahliae）病程相关基因的筛选：根据已经公布的大丽轮枝菌的序列，选择代谢相关的关键节点基因为候选基因，克隆了Vd991生理小种的32条病程相关候选基因片段利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）导入本氏烟中并使其瞬时表达，获得10个植株表现为高抗病性的片段。 ***1基因的克隆和亚细胞定位：利用RACE技术克隆到GbEDS1基因cDNA全长，GbEDS1基因长度为2064bp，开放读码框1647bp，编码548个氨基酸，在保守区域N-端存在一个磷酯酶结构。在洋葱表皮细胞中瞬时表达，发现GbEDS1蛋白的表达出现在洋葱表皮的细胞质和细胞核中，与相关文献报道拟南芥中EDS1-PAD4和EDS1-SAG101蛋白分别在细胞质和细胞核中积累结果一致。 ***1基因的诱导表达及功能分析：海岛棉苗期接种大丽轮枝菌，结果发现接种一定浓度的大丽轮枝菌的棉花植株中GbEDS1基因存在显著的差异性表达，随着接种时间的变化GbEDS1基因的表达先升高后降低的趋势。在本生烟中利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）干扰EDS1基因的表达，接种大丽轮枝菌后植株变得更易感病，推断EDS1基因对大丽轮枝菌具有一定的抗病性。

关键词：大丽轮枝菌病程相关基因 GbEDS1基因功能分析 rnai干涉

MAPK级联途径参与莱茵衣藻缺铁应答调控研究

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MAPK级联途径参与莱茵衣藻缺铁应答调控研究

作者：于俊梅海南大学

学位级别：硕士

铁是生物体十分重要不可缺少的元素,它参与体内电子传递、细胞呼吸、DNA合成以及作为辅助因子参与细胞内众多的酶促反应。铁在环境中主要以难溶的高铁离子(Fe3+)形式存在,它不能直接被机体吸收,所以缺铁是缺氮,缺磷之后的影响农业生产... 详细信息

铁是生物体十分重要不可缺少的元素,它参与体内电子传递、细胞呼吸、DNA合成以及作为辅助因子参与细胞内众多的酶促反应。铁在环境中主要以难溶的高铁离子(Fe3+)形式存在,它不能直接被机体吸收,所以缺铁是缺氮,缺磷之后的影响农业生产的第三大生理病害。高等植物缺铁会导致叶绿素合成减少,光合速率降低,严重影响植物的生长发育,造成巨大的经济损失。人体铁缺乏可导致缺铁性贫血,而过量又会引起组织损伤和铁质沉着病;所以细胞必须具备一套严格的调控机制调节铁的同化和代谢,维持细胞铁稳态。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是存在于真核生物中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,它与MAPKKK,MAPKK组成级联信号通路,接受外界刺激,其信号传递按照MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化,在真核生物分化、生长、发育和凋亡等多方面发挥重要的作用。本研究基于从莱茵衣藻缺铁应答缺陷突变体库中筛选得到一个突变体mu9,而其缺失基因Femu9p是一个MAPKKK激酶,Femu9p基因的敲除和缺失是引起铁调控基因如FOX1、ATX1、FTR、和FEA1表达的显著降低,由此推断MAPK级联信号途径可能在衣藻缺铁信号传递中发挥作用。由此,我们对莱茵衣藻中MAPK、MAPKK、 MAPKKK家族相关激酶进行研究,通过rnai干涉的技术对CrMAPK3,CrMEK1, CrMAPKKK13基因进行敲除,检测转基因藻株报告基因以及铁调控基因的表达,结果如下。(1)对莱茵衣藻的MAPK,MAPKK和MAPKKK基因家族进行生物信息学分析。所有莱茵衣藻的MAPK级联基因结构中都含有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶结构域。莱茵衣藻MAPK家族含有TXYVXTRWRAPE(L/V)保守序列,莱茵衣藻MAPKK家族含有VGTXXYMSPE保守序列,莱茵衣藻MAPKKK家族保守区核心序列属于MEKK类和Raf类,即拥有G(T/S)PX(W/Y/F)MAPEV和GTXX(W/Y)MAPE保守序列。(2)RNA-seq分析莱茵衣藻MAPK级联途径基因差异表达,对培养24h-Fe,-N、-P,16℃低温处理的莱茵衣藻进行热图的绘制,结果表明：-Fe和16℃低温下,多数MAPK级联途径基因表达降低;而-P和-N条件下,多数MAPK级联途径基因表达升局。***基因家族在-Fe,-N,-P和16℃低温下转录表达的显著改变,说明它们可能参与-Fe,-N,-P和16℃低温信号应答和调控。(3)构建CrMAPK3,CrMEK1,CrMAPKKK13 rnai表达载体并转化莱茵衣藻2A38,对转基因藻株进行细胞学和分子生物学检测。CrMAPK3 rnai干涉载体转化莱茵衣藻2A38后,共得到转化子132个。-Fe培养进行藻株的ARS活性检测,结果显示共有88个转化子表现无色或浅蓝色,变色的比例为67.7%。转基因藻株rnai11,rnai37,rnai62 CrMAPK3相对于对照mRNA分别显著下降,ARS酶活性分别降低82%,85%,83%,ARS mRNA水平降低了99%,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的mRNA水平显著下降。表明莱茵衣藻的CrMAPK3基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。CrMEK1 rnai干涉载体转化莱茵衣藻2A38后,共得到转化子81个。ARS活性检测结果显示有64个转化子表现无色,变色的比例为79.0%。转基因藻株rnai1, rnai2,rnai18目标基因CrMEK1相对于对照mRNA分别显著下降,说明对目标基因CrMEK1沉默有效。转基因藻株rnai1,rnai2,rnai18 ARS酶活性和mRNA水平显著下降,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的表达量均降低。表明莱茵衣藻CrMEK1基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。CrMAPKKK13 rnai干涉转基因藻株共得到84个。ARS活性检测结果显示有70个转化子表现无色,变色的比例为83.3%。转基因藻株rnai4,rnai16,rnai51目标基因CrMAPKKK13相对于对照mRNA分别显著下降,ARS酶活性和mRNA水平显著下降,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的表达量均降低。表明莱茵衣藻CrMAPKKK13基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。(4)莱茵衣藻CrMAPK3和CrMEK1定位于细胞质。

关键词：莱茵衣藻 MAPK途径 CrMAPK3 CrMEK1 CrMAPKKK13 缺铁应答 rnai干涉

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基因敲除技术研究进展

生物技术通报 2008年第2期24卷 80-82,92页

作者：李樊刘义何钢中南林业科技大学生命科学与技术学院中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所长沙410004

基因中断技术是研究基因功能和实现基因的精确缺失重要手段。原核中断系统最近发展较快的是利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行的基因敲除技术,但多在大肠杆菌中进行;真核中断系统属PCR介导的酵母基因中断技术和rnai干涉技术发展最快。... 详细信息

基因中断技术是研究基因功能和实现基因的精确缺失重要手段。原核中断系统最近发展较快的是利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行的基因敲除技术,但多在大肠杆菌中进行;真核中断系统属PCR介导的酵母基因中断技术和rnai干涉技术发展最快。这几种中断技术都大大简化了实验操作,缩短了实验时间,在研究生物基因组中未知基因及蛋白质的功能等领域具有诱人的应用前景。

关键词：基因敲除 Red系统酵母 rnai干涉

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RNA干涉作用机制的研究进展

医学综述 2005年第4期11卷 291-294页

作者：何承伟刘芳刘新光梁念慈广东医学院生物化学与分子生物学研究所广东湛江524023

Dicer酶、RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)、RNA干涉(transitive rnai)信号的扩增及迁移rnai等的发现,初步搭建了rnai机制的框架.原来小RNA(此应称为小干涉RNA)是长的双链RNA或发夹结构RNA经Dicer酶切割而成,... 详细信息

关键词： rnai干涉作用机制系统性基因沉默