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Caging-Decaging Strategies to Realize Spatiotemporal Control of dnazyme Activity for Biosensing and Bioimaging

Chemical Research in Chinese Universities 2022年第4期38卷 902-911页

作者： ZHANG Qian LIANG Yuyan XING Hang Institute of Chemical Biology and Nanomedicine State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and ChemometricsHunan UniversityChangsha410082P.R.China College of Chemistry and Chemical Engineering Hunan UniversityChangsha410082P.R.China College of Biology Hunan UniversityChangsha410082P.R.China

dnazymes with rna-cleaving activity have been widely used as biosensing and bioimaging tools for detection of metal *** the achievements,dnazyme-based biosensors sometime suffer from false positive signals and unexpected off-target turn-on in biological environments,which are likely due to the unstable nature of the rna *** to control dnazyme activity in order to improve the sensing performance remain a significant *** meet the challenge,there is growing interest to develop synthetic strategies that can cage native dnazyme under undesired conditions and reactivate it in target environment in order to function in a controlled manner.A variety of caging-decaging strategies have been developed to realize spatiotemporal control of the dnazyme activity,improving its specificity and sensitivity as well as extending its application *** this review,we focus on strategies to regulate the catalytic activity of dnazyme,highlight the nucleic acid modification chemistries,and summarize three strategies to cage dnazyme *** of using caged dnazyme for bio-applications have also been reviewed in ***,we provide our perspectives on the potential challenges and opportunities of this emerging research topic that could advance the dnazyme field.

关键词： rna-cleaving dnazyme Caging-decaging strategy Spatiotemporal control Biosensing Bioimaging

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在有机溶剂中检测黄曲霉毒素适配体酶传感器的开发

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作者：李光平河南理工大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）是已知最强致癌物之一,易污染花生、玉米、小麦等农产品及其食品。AFB1分子量小、不溶于水而易溶于甲醇等有机溶剂,开发耐有机溶剂的AFB1快速检测方法对保护食品安全有重要意义。切割rna的脱氧核酶（R... 详细信息

黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）是已知最强致癌物之一,易污染花生、玉米、小麦等农产品及其食品。AFB1分子量小、不溶于水而易溶于甲醇等有机溶剂,开发耐有机溶剂的AFB1快速检测方法对保护食品安全有重要意义。切割rna的脱氧核酶（rna-cleaving dnazyme,RCD）是具有催化活性的一类功能核酸。因其易合成、易修饰、稳定性高,在生物传感器设计中广泛应用。利用课题组前期得到依赖DMSO的RCD,本文尝试以其为骨架,设计随机文库,利用体外筛选技术在40%甲醇中筛选能特异性识别AFB1的适配体酶。取得以下成果:1、首先将顺式RCD改造为反式。延长底物与dnazyme的结合臂成功将其改造成只需一个结合臂即可捕获底物进而高效切割底物的反式RCD,使其具有多转换的性质;底物中Dabcyl修饰可提高RCD的催化活性120倍以上。对反式RCD进行表征,明确了高度保守的核苷酸序列和其中对催化活性至关重要的核苷酸（G3、T4、G6、G8和A14）以及可变区域;通过甲基化修饰腺苷或将鸟嘌呤替换为碱基类似物证实了G3、G6、G8以及A14对催化至关重要,这些研究表明,RCD采用茎环和单链悬垂作为催化核心,并采用可变链接将催化核心与底物结合臂连接起来。RCD的表征为其作为生物传感器或筛选新分子探针奠定基础。2、AFB1特异性响应的适体酶筛选。在上述RCD中引入40个随机序列,连接rna底物构建筛选文库,以AFB1为靶标筛选被其激活的适体酶。以40%甲醇-缓冲溶液作为反筛条件,以溶解在40%甲醇-缓冲液中的AFB1为正筛条件,一共进行了12轮筛选。筛选进程监控发现筛选文库催化活性整体升高,但并未对AFB1有明显响应。高通量测序得到了一个在甲醇溶液有极高催化活性的RCD（TJ11-3Dz）,手动测试极限时间内（5秒）即可催化底物完全切割,相对原始RCD其活性提升了约15000倍。优化反应条件,在50%甲醇中TJ11-3Dz催化底物多转换常数为33.45 min-1,是已知最快的RCD 10-23的3.3倍,在催化速度上突破二十多年的瓶颈;且在几种常用有机溶剂中的催化活性都高于RCD 10-23。进一步将TJ11-3Dz设计成由核酸序列激活的多组分酶,可实现对特定核酸序列的高选择性和高灵敏度响应。3、改变实验条件重新筛选。通过改变甲醇、靶标的浓度、正反筛孵育时间等,利用上述策略设计的文库,进行了多次重新筛选。其中一个筛选经过11轮富集,发现文库对AFB1有一定响应,且具有浓度剂量效应,但背景切割仍然较高。如何降低无效切割反应,提高对靶分子的感应能力是下一步筛选的重点。图22幅,表26个,参考文献84篇。

关键词：核酸适体体外筛选 rna-cleaving dnazyme 适配体酶有机溶剂 AFB1

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依赖DMSO的脱氧核酶在环境分析中的应用

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作者：郑星河南理工大学

学位级别：硕士

切割rna的脱氧核酶(rna-cleaving dnazyme,RCD)可在特定因子辅助下对rna底物进行剪切,产生可被放大的检测信号,是一种既有信号识别元件又有信号输出单元的理想生物传感器,在环境监测、食品安全等领域中显示出应用前景。课题组前期通过... 详细信息

切割rna的脱氧核酶(rna-cleaving dnazyme,RCD)可在特定因子辅助下对rna底物进行剪切,产生可被放大的检测信号,是一种既有信号识别元件又有信号输出单元的理想生物传感器,在环境监测、食品安全等领域中显示出应用前景。课题组前期通过定向进化技术得到了能够在35%二甲基亚砜(DMSO)中高效切割rna底物的RCD(命名为t57r31),并对其进行了系统的二级结构表征。本文在此基础上对该DNA催化剂进行工程化设计,希望在含有机溶剂的体系中对重金属离子Hg以及新型冠状病毒(SARS-Co V-2)基因组的核酸序列进行特异性响应,以期为开拓其在环境分析中的应用奠定基础。Hg及其化合物是环境中最受关注的高毒性重金属,为构建特异性响应Hg的生物传感器,将t57r31劈开改造为“拉链式”多组分酶(multiple component dnazyme,MNAzyme),希望通过Hg与胸腺嘧啶(T)特异性结合形成T-Hg-T结构,进而将MNAzyme激活。首先设计并证实了可被互补序列形成的双链结构激活的“拉链式”MNAzyme;但发现Hg并未能激活由T-T错配序列构成的MNAzyme,反而抑制了RCD的底物切割活性,且表现了浓度剂量效应。本文对RCD序列、切割底物、溶液中的金属离子以及缓冲溶液p H值等条件逐一排查,最后发现p H值条件对Hg抑制RCD活性起重要作用。为了研究Hg抑制是否有特异性,对不同二价金属离子(Zn、Co、Mg、Pb、Cu、Ca、Fe)进行普查,发现除了Hg外,Fe也强烈抑制RCD的活性,Zn、Co、Pb、Cu有轻微抑制作用,Ca对RCD活性没有作用。本文虽然未能构筑特异性响应Hg的MNAzyme,但发现了重金属离子对RCD的毒性效应,提示RCD应用于检测时需要考虑金属离子可能导致的催化剂中毒,该结果也为研究DMSO依赖的RCD反应机理提供了线索。可在环境传播的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)对人类健康和社会发展构成了巨大的威胁。为了构建rna病毒基因信息的免转录、直接检测策略,本文在“拉链式”MNAzyme基础上,进一步对DMSO依赖的RCD劈开位点进行筛选,发现了6个可以用于劈开设计的位点。选择了对靶序列长度要求高、催化速率快的F位点重新设计MNAzyme,希望能通过与此区域两段DNA链互补配对的DNA序列作为靶标,以“胶带式”粘合组装MNAzyme激活其切割活性,实现对目标核酸序列的精准响应。从新型冠状病毒的E、N和ORf1b基因以及流感病毒基因组中选择30-nt长度的序列作靶标,最后优化设计了对5个靶序列快速响应的MNAzymes。这些MNAzymes对其识别的靶序列没有交叉响应,表现出极高的特异性。进一步研究发现双链DNA靶标和单链rna也能激活“胶带式”MNAzyme。可被靶标激活的“胶带式”MNAzyme,将有望用于单链rna病毒、micro rna以及双链DNA的特异性检测;尤其是新冠病毒等单链rna病毒,将可在有机溶剂灭活条件下直接用本文设计的传感器进行检测,有望跳过传统rna病毒检测中繁琐的反转录步骤,在复杂环境中实现现场快速检测rna病毒。综上,本文发现了DMSO依赖的RCD的催化活性受到部分重金属离子的抑制,发现了其可供工程化改造的位点以及对不同DNA“拉链”序列的长度依赖性,构建了一种能够在含有机溶剂的反应体系中精准响应特定核酸靶标的通用型生物传感器。本文研究成果为进一步研究其催化机理提供了线索,也为将来引入新的识别元件构建难溶于水的有害分子的智能响应型生物传感器奠定基础。

关键词： rna-cleaving dnazyme 新型冠状病毒快速检测生物传感器 Hg2+ 有机溶剂

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