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CDK抑制剂夫拉平度抗冠状病毒作用机制研究

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药学学报 2024年第5期59卷 1280-1285页

作者：王丽丹郭赛赛岑山中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

冠状病毒属冠状病毒包含多种人类致病病毒,抗冠状病毒药物研发具有重要价值。开发靶向宿主细胞的抗病毒药物不仅有助于发展新的抗病毒策略,同时有利于解决病毒突变而带来的耐药性等问题。本课题组前期研究发现,细胞周期依赖性蛋白激酶(c... 详细信息

冠状病毒属冠状病毒包含多种人类致病病毒,抗冠状病毒药物研发具有重要价值。开发靶向宿主细胞的抗病毒药物不仅有助于发展新的抗病毒策略,同时有利于解决病毒突变而带来的耐药性等问题。本课题组前期研究发现,细胞周期依赖性蛋白激酶(cell cycle-dependent protein kinases,CDKs)参与冠状病毒的复制,成为潜在的抗病毒靶点。本研究发现广谱CDK抑制剂夫拉平度显著抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) rna依赖性rna聚合酶(rna dependent rna polymerase,RdRp)活性。进一步研究表明,夫拉平度抑制SARS-CoV-2 RdRp的rna合成效率。此外,夫拉平度能够有效抑制人类冠状病毒OC43 (human coronavirus OC43,HCoV-OC43)的复制。本研究表明,CDK抑制剂夫拉平度可能是潜在的抗冠状病毒药物。

关键词：夫拉平度 CDK抑制剂冠状病毒抗病毒 rna依赖性rna聚合酶

rna依赖性rna聚合酶抑制剂类抗丙型肝炎药Setrobuvir

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药学进展 2013年第7期37卷 351-352页

作者：范鸣

丙型肝炎（简称丙肝）病毒（HCV）是一种单股正链rna病毒,入侵机体后可导致急、慢性肝炎以及肝硬化、肝衰竭甚至死亡。目前,HCV靶向治疗药物除了HCV蛋白酶抑制剂（PI,如telaprevir、boceprevir等）外,还有靶向HCV中rna依赖性rna聚合酶N... 详细信息

丙型肝炎（简称丙肝）病毒（HCV）是一种单股正链rna病毒,入侵机体后可导致急、慢性肝炎以及肝硬化、肝衰竭甚至死亡。目前,HCV靶向治疗药物除了HCV蛋白酶抑制剂（PI,如telaprevir、boceprevir等）外,还有靶向HCV中rna依赖性rna聚合酶NS5B的直接抗病毒药（DAA）。DS5B的功能就是合成互补的负链rna,为复制子代正链rna病毒提供模板。

关键词： setrobuvir rna依赖性rna聚合酶丙型肝炎病毒直接抗病毒药

我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株rna聚合酶的表达与功能表征

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微生物学通报 2022年第3期49卷 964-974页

作者：蔡淑珍高珺珊薛亮程彤王林平梁燕惠张菊梅吴清平广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东广州510070

【背景】诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要食源性病原体。目前尚无获批的诺如病毒疫苗和药物,诺如病毒rna依赖性rna聚合酶(RdRp)是当前抗诺如病毒药物开发的主要靶点。【目的】表达我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株的RdRp... 详细信息

【背景】诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要食源性病原体。目前尚无获批的诺如病毒疫苗和药物,诺如病毒rna依赖性rna聚合酶(RdRp)是当前抗诺如病毒药物开发的主要靶点。【目的】表达我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株的RdRp并系统地表征其复制特征。【方法】基于大肠杆菌系统表达并纯化得到高纯度可溶性的GII.P12/GII.3诺如病毒RdRp蛋白,通过体外rna合成实验确定温度、模板、底物和盐浓度对RdRp功能的影响。【结果】GII.P12/GII.3诺如病毒的RdRp在30℃、1mmol/L氯化锰条件下酶活性最佳。酶动力学实验表明底物GTP和模板polyC的Km值分别为79.0μmol/L和10.6μg/mL。体外抑制试验表明,RdRp在微摩尔范围内可被利巴韦林、法维拉韦和NF023有效抑制,半数最大抑制浓度分别为23、59和11μmol/L。【结论】首次表征了诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株RdRp的酶学特性。基于荧光的酶活性测试表明,RdRp在体外具有催化活性,这为诺如病毒RdRp抑制剂的筛选及诺如病毒感染的治疗提供了良好的技术和理论支持。

关键词：诺如病毒 rna依赖性rna聚合酶 GII.P12/GII.3 抑制剂

基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 162-168页

作者：纪玉洁郭兴张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为同时制备B型流感病毒rna依赖性rna聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(... 详细信息

为同时制备B型流感病毒rna依赖性rna聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×10^(5)~1:6.4×10^(4),分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株MAb,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

关键词： B型流感病毒 rna依赖性rna聚合酶 ANP32蛋白单克隆抗体

聚合酶RdRp结构域对水疱性口炎病毒rna合成活性影响的初步研究

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聚合酶RdRp结构域对水疱性口炎病毒RNA合成活性影响的初步研究

作者：张永芝中国农业科学院

学位级别：硕士

水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是一种具有囊膜结构、不分节段单股负链rna病毒,编码5种结构蛋白包括核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、及聚合酶蛋白(L),因其结构简单、复制能力较高、疾病过程快速、... 详细信息

水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是一种具有囊膜结构、不分节段单股负链rna病毒,编码5种结构蛋白包括核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、及聚合酶蛋白(L),因其结构简单、复制能力较高、疾病过程快速、病毒复制时rna序列不会整合到宿主细胞基因组上,因此常被作为研究负链rna病毒的模型。VSV的rna依赖性rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase,Rd Rp)是一种独特的核酸聚合酶,其以单链rna为模板催化NTP形成磷酸二酯键合成互补rna链,在病毒基因组复制和转录过程中发挥核心作用。Rd Rp在整个病毒生命周期中具有至关重要的作用,对它的深入研究有利于更好的理解病毒的生命活动,对于抗病毒药物及疫苗的研发以及探究病毒进化过程中的自我修复机制具有重要的理论和指导意义。根据VSV-L蛋白复合物晶体结构B-factor,本研究初步筛选出Rd Rp柔性Loop区域中的氨基酸点位S194、H195、G196、L592、K593、I753、R728、R998,分别将其突变为丙氨酸(Alanine,A),使其失去活性。将构建成功的突变质粒、辅助质粒及p Luc转染到经重组痘病毒感染的BSRT7细胞中,经mini-genome荧光素酶报告基因系统筛选,最终得到显著抑制rna合成活性的位点L-S194A和L-R728A。将L-S194A和L-R728A引入VSV全长病毒基因组,构建VSV全长突变质粒。利用反向遗传学技术在低温31℃条件下拯救突变病毒,拯救成功后连续传代进行病毒进化诱导实验。病毒在31℃传至F2代,在37℃传至F23代。突变病毒在传代过程中其自我修复能力逐渐恢复,当病毒的复制能力恢复到与野生型水疱性口炎病毒相近时,对病毒进行全基因组测序。测序结果经与野生型水疱性口炎病毒的序列比对,发现R728A的补偿位点V815I、Q1994R,S194A的补偿位点E92K,初步确定补偿位点的自我修复作用,为后期Rd Rp自我修复机制的研究奠定基础。

关键词：水疱性口炎病毒 rna依赖性rna聚合酶病毒拯救

鸭病毒性肝炎病毒rna聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

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中国兽医科学 2012年第1期42卷 35-38页

作者：王超李传峰陈宗艳付玉志吴润刘光清中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

为研究鸭病毒性肝炎病毒rna依赖性rna聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了rna依赖性rna聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4... 详细信息

为研究鸭病毒性肝炎病毒rna依赖性rna聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了rna依赖性rna聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了rna依赖性rna聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,rna依赖性rna聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了rna依赖性rna聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现rna依赖性rna聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。

关键词：鸭病毒性肝炎病毒 rna依赖性rna聚合酶亚细胞定位

人源诺如病毒rna聚合酶复制分子机制及抗病毒益生菌筛选研究

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人源诺如病毒RNA聚合酶复制分子机制及抗病毒益生菌筛选研究

作者：程彤陕西科技大学

学位级别：硕士

诺如病毒是导致人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,可在全球范围内导致急性胃肠炎的散发及暴发流行,严重威胁着人类健康。由于变异快且缺乏稳健的体外细胞培养体系及小动物感染模型,严重阻碍了对诺如病毒的全面认识,目前尚无批准的诺如... 详细信息

诺如病毒是导致人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,可在全球范围内导致急性胃肠炎的散发及暴发流行,严重威胁着人类健康。由于变异快且缺乏稳健的体外细胞培养体系及小动物感染模型,严重阻碍了对诺如病毒的全面认识,目前尚无批准的诺如病毒有效疫苗及特异性抗病毒药物。丰富的遗传多样性是其持续传播的关键因素,快速复制与易突变等特点促使变异株不断出现。然而,各型别毒株复制能力的差异对及其流行危害水平的影响仍不清楚。诺如病毒的rna依赖性rna聚合酶（RdRp）在病毒基因组转录及亚基因组合成和扩增中发挥关键作用,是当前诺如病毒抗病毒药物开发的主要靶点。本课题以诺如病毒流行差异毒株的聚合酶为研究对象,主要从RdRp的复制水平方面研究了导致人源诺如病毒不同毒株流行差异的分子机制。此外,还建立了一种简单、灵敏、快速且稳定的诺如病毒RdRp酶活测定新方法,并将其用于抗病毒益生菌的高通量筛选。主要研究结果如下:（1）诺如病毒流行差异毒株RdRp的制备与酶学性质表征为了研究诺如病毒流行差异毒株RdRp的复制水平,首先基于大肠杆菌表达系统高效表达了人源诺如病毒各流行差异毒株的RdRp,并通过亲和层析法纯化得到了高纯度可溶性的RdRp蛋白。体外rna合成实验表明纯化所得的RdRp具有生物学活性,且不同毒株RdRp的体外催化活性具有一定差异。在相同反应条件下,流行株GⅡ.P17/GⅡ.17-L343的聚合酶在单位时间利用底物生成的双链rna产物最多,酶活最高,非流行株GⅡ.P8/GⅡ.8-L601的酶活最小,而重组株GⅡ.P12/GⅡ.3-L20的RdRp活性介于流行株及非流行株之间。各毒株RdRp的Km值也证实了这一结果,不同毒株的Km值各不相同,介于0.013-0.151 mM之间。与其他毒株相比,流行株GⅡ.P17/GⅡ.17-L343的Km值最小,为0.013 mM,表明其与底物的亲和能力最大,在较低的底物浓度条件下即可达到最大反应速率。而GⅡ.P8/GⅡ.8-L601的Km值最大,为0.151 mM,表明其与底物的亲和能力最小。因此,在相同的低底物浓度下,GⅡ.P17/GⅡ.17-L343 RdRp催化产物双链rna生成的量更多,其酶活也最高。此外,通过系统评估模板、底物、盐浓度及反应温度等因素对RdRp活性的影响,确定了各型别毒株RdRp表现最优催化活性的最适反应条件。各毒株RdRp的最适反应温度介于15-30℃之间,在锰离子浓度为1 mM条件下表现出最佳活性,对模板和底物的利用率各不相同,但均符合标准的米氏方程。（2）影响诺如病毒RdRp复制速率的分子机制研究诺如病毒流行差异毒株RdRp的氨基酸序列比对结果表明不同毒株的RdRp序列整体上高度相似,然而在其保守基序中发现了少量的氨基酸替代,这些氨基酸位点的变异是否会影响RdRp的复制水平,从而导致不同毒株流行能力间的差异。鉴于GⅡ.17和GⅡ.8型毒株RdRp酶活间的巨大差异,因此,我们选择流行株GⅡ.17与非流行株GⅡ.8的RdRp为研究对象,通过理性设计RdRp突变体,筛选影响聚合酶活性的关键氨基酸位点,以研究导致两者活性差异的分子机制。通过原核表达系统制备了一系列GⅡ.8 RdRp突变体蛋白,并基于rna合成实验测定了它们的酶促活性。酶活测定结果表明聚合酶氨基酸序列的改变的确会影响其催化活性,且导致诺如病毒流行株GⅡ.17与非流行株GⅡ.8酶活差异的关键氨基酸位点位于160位。160位甲硫氨酸到缬氨酸的突变（M160V）可使GⅡ.8 RdRp的催化活性增强43%,并且此突变位点位于聚合酶的保守基序F1中,F基序被证明主要参与核苷三磷酸的转移反应,促进rna的合成,因此对RdRp的复制速率具有重要影响。以上结果表明,人源诺如病毒rna聚合酶保守氨基酸位点的改变会显著影响其复制动力学,且诺如病毒不同毒株的复制水平与其流行性间存在一定的相关性,RdRp单点突变对病毒复制和流行性的影响突显了复制速率与病毒适应性及流行性间的动态相互作用。（3）基于益生微生物的诺如病毒RdRp抑制剂筛选建立了一种基于荧光染料的简单、灵敏、快速且稳定的诺如病毒聚合酶活性测定新方法,并可广泛用于病毒聚合酶抑制剂的快速、高通量筛选。新方法所得实验数据比较稳定,反应成本较低并且可实时监测反应过程。基于RdRp测活新方法,评估了化合物抑制剂对诺如病毒RdRp的抑制效果,发现核苷类及非核苷类抑制剂利巴韦林、法韦拉韦和NF023均能在微摩尔范围内有效抑制RdRp的从头合成活性,半数最大抑制浓度（IC50值）分别为23 μM、59 μM和11 μM。此外,基于团队积累的益生微生物资源,进行了抗病毒益生菌的筛选研究,共从71株益生菌中筛选出了多株对诺如病毒RdRp具较强抑制作用的微生物抑制剂,其中,发酵乳杆菌PV22和植物乳杆菌PV66对Rd

关键词：诺如病毒 rna依赖性rna聚合酶体外酶活测定抑制剂益生微生物

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法匹拉韦抗新型冠状病毒的机制研究进展

医药导报 2022年第11期41卷 1651-1659页

作者：阿热依·巴哈提王均琪祝娜白颖璐曹靖宜张明烁张严李志勇黄秀兰中央民族大学药学院北京100081 中央民族大学生命环境与科学学院北京100081 中国中医科学院中药研究所北京100700

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)所致的传染病,自2019年末以来在全球迅速传播。当前科学界正进行前所未有的努力,研究该病毒感染的潜在机制并提出合理的临床应用药物,以降低COVID-19发病... 详细信息

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)所致的传染病,自2019年末以来在全球迅速传播。当前科学界正进行前所未有的努力,研究该病毒感染的潜在机制并提出合理的临床应用药物,以降低COVID-19发病率。法匹拉韦(favipiravir)是一种rna依赖性rna聚合酶(RdRp)抑制剂,在中国被批准用于治疗COVID-19。该文概述法匹拉韦通过结合SARS-CoV-23种关键病毒酶RdRp、3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)抑制SARS-CoV-2的机制,并综述法匹拉韦与上述病毒蛋白酶的分子对接数据。

关键词：法匹拉韦新型冠状病毒肺炎 rna依赖性rna聚合酶 3-胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶样蛋白酶

β冠状病毒通用RT-PCR检测方法建立及昆明地区动物带毒状况调查

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生物学杂志 2023年第1期40卷 74-78页

作者：邓晏琼李德氾李晓红宋春莲舒相华齐晓朋陈培富云南农业大学动物医学院昆明650201 中国科学院昆明动物研究所昆明650201

为调查昆明地区猪、牛及鼠β冠状病毒携带状况及充当重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2中间宿主的可能性,建立基于β冠状病毒属rna依赖性rna聚合酶(RdRp)的特异性逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法,并用于2020—2021年昆明9... 详细信息

为调查昆明地区猪、牛及鼠β冠状病毒携带状况及充当重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2中间宿主的可能性,建立基于β冠状病毒属rna依赖性rna聚合酶(RdRp)的特异性逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法,并用于2020—2021年昆明9个县区具有呼吸道或消化道症状的猪(186份)、牛(164份)及随机捕获的鼠(140份)的β冠状病毒核酸检测;对RdRp阳性样品进一步进行SARS-CoV-1和SARS-CoV-2刺突蛋白(S)基因特异性扩增。建立的RT-PCR方法能特异扩增β冠状病毒属各病毒种,对SARS-CoV-2核酸检测的灵敏度为310个质粒拷贝;应用该法检测的490份样品中,猪、牛、鼠的β冠状病毒检出率分别为5.91%、9.76%和8.57%,但RdRp阳性样品未检出SARS-CoVs的S基因同源片段。成功建立可特异检测β冠状病毒属的通用RT-PCR方法,应用该法联合S基因扩增调查昆明地区猪、牛及鼠,未发现其携带与SARS-CoVs的S基因有联系的β冠状病毒。

关键词：哺乳动物 β冠状病毒 rna依赖性rna聚合酶逆转录-聚合酶链式反应