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hprna的茎环比例对rna介导的病毒抗性产生的影响

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hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

作者：李云山东农业大学

学位级别：硕士

rna介导的病毒抗性是rnai在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的rna降解过程中,rna降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因rna一起降解。新的研究... 详细信息

rna介导的病毒抗性是rnai在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的rna降解过程中,rna降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因rna一起降解。新的研究证明发生于不同物种上的rna沉默的直接引发因子都是双链rna(double stranded rna,dsrna),在不同生物中dsrna有多种形成方式。对于转基因(正义和反义)来说,dsrna最有效的形成途径是体外构建具有反向重复结构(Inverted Repeat, IR)的cDNA引入转基因植株,这种IR结构在体内转录后形成发夹rna(hairpin rna, hprna)。hprna中的dsrna部分决定了反应的特异性,是诱发基因沉默的关键部位,它的长度和来源均影响所诱导的rna沉默的效率。hprna间隔区段的长度可影响转基因转录后hprna的形成和稳定性,进而影响基因沉默的效率。一般认为短的间隔序列有利于hprna的形成,保持其高度稳定性,获得较高的沉默效率;但研究中也发现间隔序列过短往往影响IR序列在细菌内的稳定性,影响具反向重复结构基因的克隆。适宜的茎环比例,可能是获得高基因克隆效率和高基因沉默效率的关键。本研究选用了PVYNCP基因3’端50bp序列作为hprna的茎,以克隆载体pUC19不同长度的序列为环,构建了具有不同茎环比例的hprna结构的植物表达载体,转化烟草,研究了茎环比例对rna介导的病毒抗性产生的影响。研究结果将为高效hprna的设计提供依据。具体结果如下:1.分别克隆PVYNCP 3’端704-754之间50bp的片断作为hprna结构的茎,以pUC19序列上的部分片段为hprna的环,构建植物双元表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1:8。2.将所构建的重组植物表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1﹕8及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。3.叶盘法转化烟草NC89。用卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草40株,转pROK-4:1的烟草143株,转pROK-2﹕1的烟草152株,转pROK-1﹕1烟草130株,转pROK-1﹕2的烟草135株;转pROK-﹕4的烟草132株;转pROK-1﹕8的烟草126株。4.转基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性存在差异。从抗病性测试结果来看,在143株转pROK-4﹕1的T0代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为57.34%;152株转pROK-2﹕1的T0代烟草中,有94株表现高度抗病,抗性植株比例为61.84%;130株转pROK-1﹕1的T0代烟草中,有78株表现高度抗病,抗性植株比例为60.00%;135株转pROK-1﹕2的T0代烟草中,有69株表现高度抗病,抗性植株比例为51.11%;132株转pROK-1﹕4的T0代烟草中有72株表现高度抗病,抗性植株比例为44.69%;126株转pROK-1﹕8的T0代烟草中有12株表现高度抗病,抗性植株比例为9.52%。从发病的情况可以看出转基因植株中抗性植株的比例与茎环比例呈一定相关性。5.分别选取抗病性表现不同(抗病和感病)的部分转基因植株提取总DNA进行Southern blot分析,分析转基因的拷贝数与抗病性间的关系。结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。6.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在rna水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为rna介导的抗病性,是rna沉默的结果。

关键词：马铃薯Y病毒 rna介导的病毒抗性 hprna 茎环比例

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转基因植物中rna介导的病毒抗性研究进展

生命科学 2000年第4期12卷 166-169,161页

作者：郭兴启温孚江朱常香浙江大学植保系杭州3100292 山东农业大学生命科学学院泰安271018

利用病毒核酸序列培育抗病毒的转基因植物是一个重要的抗病毒基因工程策略。虽然很多种病毒的不同核酸序列已被使用并证明转基因植物有不同程度的抗病毒效果，但其抗病机制大多不清楚。目前至少有两种明显不同的抗病机制类型：一种是要... 详细信息

利用病毒核酸序列培育抗病毒的转基因植物是一个重要的抗病毒基因工程策略。虽然很多种病毒的不同核酸序列已被使用并证明转基因植物有不同程度的抗病毒效果，但其抗病机制大多不清楚。目前至少有两种明显不同的抗病机制类型：一种是要求病毒编码的蛋白质的表达；另一种是仅仅依靠转基因的rna转录。本文综述了这种rna介导的抗性特点、分子生物学、抗病机制，以及与共抑制的相似性，并对rna介导的病毒抗性的意义加以讨论。

关键词：转基因植物 rna介导的病毒抗性共抑制

不同病毒基因排列顺序对rna介导的多病毒抗性的影响

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不同病毒基因排列顺序对RNA介导的多病毒抗性的影响

作者：邢芳宇山东农业大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是烟草生产中危害严重的三种病毒,严重影响植物生长,造成重大的经济损失,培育抗病型品种势在必行。rna介导的病毒... 详细信息

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是烟草生产中危害严重的三种病毒,严重影响植物生长,造成重大的经济损失,培育抗病型品种势在必行。rna介导的病毒抗性是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略,具有抗性持久、抗病程度高、生物安全性高等优点,为植物抗病毒策略提供了新的途径。本实验以马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因、马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)、烟草花叶病毒(TMV)的抑制子基因(p126)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹rna(hairpin rna,hprna)结构的植物表达载体,通过电激法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89。对获得的转基因烟草进行抗性鉴定,比较不同病毒基因排列顺序的嵌合基因对rna介导的病毒抗性的影响,为培育多抗病毒的转基因植株提供依据。研究获得的主要结果和结论如下:(1)根据已克隆出的CMV CP基因和2b基因、PVY CP基因和HC-pro基因、TMV CP基因和p126基因的全序列,设计并合成引物,通过PCR扩增获得长度为300bp的cDNA的片段,按不同排列顺序拼接成嵌合基因,进而分别反向重复插入双元载体pROKⅡ中,构建不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹rna(hairpin rna,hprna)结构的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC。(2)将构建好的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC通过电激法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草NC89。经过卡那霉素的筛选和PCR的鉴定,最终获得转基因pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC的T0代植株102株、103株、116株、114株、105株、108株。(3)转基因植株的Southern杂交结果表明外源目的基因已成功地整合到了烟草基因组中。(4)转基因植株的Northern杂交结果表明转基因在rna水平上都得到了表达,接毒感病的转基因烟草中总rna的积累量明显高于接毒抗病的转基因烟草,也就是说目的基因的rna的积累量与抗性能力呈现负相关,由此也证明转基因植株产生的病毒抗性是rna介导产生的病毒抗性。(5)转基因植株的目的序列的sirna的Northern杂交分析证明初级rna在体内进行了表达,次级rna在转录翻译的同时发生了信号的传递,向目的基因的上游和下游方向延伸,荧光定量PCR结果表明不同基因排列顺序的转基因植株的总rna的表达量不同。

关键词：马铃薯Y病毒黄瓜花叶病毒烟草花叶病毒 sirna rna介导的病毒抗性

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

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中国农业科学 2006年第6期39卷 1153-1158页

作者：竺晓平朱常香宋云枝温孚江刘红梅李向东山东农业大学植物保护学院山东农业大学生命科学学院

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生rna介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试... 详细信息

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生rna介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与rna的表达量呈现负相关。结论抗病性是rna介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。

关键词：马铃薯Y病毒 rna介导的病毒抗性 Dsrna rna沉默

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

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植物保护学报 2010年第3期37卷 227-233页

作者：徐丽宋云枝王文俊朱常香温孚江山东农业大学植物保护学院泰安271018 山东农业大学作物生物学国家重点实验室泰安271018 山东农业大学作物生物学国家重点实验室泰安271018 山东农业大学生命科学学院泰安271018

为探究靶序列位置对rna介导的病毒抗性产生的影响，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）复制酶基因（nuclear inclusion b，NIb）不同位置的cDNA区段，反向插入双元载体pR... 详细信息

为探究靶序列位置对rna介导的病毒抗性产生的影响，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）复制酶基因（nuclear inclusion b，NIb）不同位置的cDNA区段，反向插入双元载体pROKII中，构建了发夹rna（hairpin rna，hpR—NA）结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草NC89，获得转基因植株。攻毒试验表明：PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异；3’端1／2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性，抗性植株的比例在50％以上，而5‘端、5’端1／2处和3’端的序列介导的抗性效率较低，抗性植株的比例仅为10％～30％。Northern杂交显示：抗病植株中rna的积累量明显低于同类型的感病植株，抗性与rna积累量呈负相关；抗病转基因植株中有sirna存在，表明病毒抗性是由rna介导的。

关键词：马铃薯Y病毒复制酶基因 rna介导的病毒抗性

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

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植物病理学报 2010年第1期40卷 57-65页

作者：刘静陈雪梅宋云枝吴斌朱常香温孚江山东农业大学植物保护学院泰安271018 山东农业大学作物生物学国家重点实验室泰安271018

根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3′端400bpcDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结... 详细信息

根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3′端400bpcDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构rna(intron splicing hprna,ihprna)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子rna和sirna的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到sirna,说明所获得的抗病性是rna沉默介导的。

关键词：马铃薯Y病毒 rna介导的病毒抗性 ihprna表达载体

马铃薯Y病毒NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CP基因介导的病毒抗性的比较研究

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马铃薯Y病毒NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CP基因介导的病毒抗性的比较...

作者：陈雪梅山东农业大学

学位级别：硕士

rna沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,其本质是转录后的基因沉默(PTGS),一般由dsrna引发。体外构建的hprna可以高效地诱发基因沉默。一个病毒基因组编码多种功能蛋白,不同的蛋白在病毒复制、增殖和传播等过程中有着不同的功能,干... 详细信息

rna沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,其本质是转录后的基因沉默(PTGS),一般由dsrna引发。体外构建的hprna可以高效地诱发基因沉默。一个病毒基因组编码多种功能蛋白,不同的蛋白在病毒复制、增殖和传播等过程中有着不同的功能,干扰不同基因表达可能诱发不同的基因沉默效果。本研究以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的rna为模板,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,克隆了NIa-Vpg、NIa-Pro基因;进而利用PCR扩增了NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb和CP等4个基因的3′端400bp和500bp片段,反向插入到双元表达载体pROKII中,构建了4个hprna结构的植物表达载体。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR检测,获得了转基因植株。大分子rna和sirna的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,可检测到sirna,证明所获得的抗病性是rna介导的抗病性。研究结果对于将来有效地选择靶位点序列和成功应用rna介导的病毒抗性策略提供依据,具有重大指导意义。具体结果如下: 1.利用RT-PCR技术,分别克隆PVYN的NIa-Vpg、NIa-Pro基因;进而利用PCR扩增了NIa-Vpg、NIa-Pro和NIb、CP(由实验室前期克隆)等4个基因3′端的400bp和500bp片段,分别插入到双元表达载体pROKⅡ中,构建茎长度为400bp,环长度100bp的发夹结构的植物表达载体pROKⅡ-NIa-Vpg、pROKⅡ-NIa-Pro、pROKⅡ-NIb、pROKⅡ-CP。 2.将所构建的植物表达载体pROKⅡ-NIa-Vpg、pROKⅡ-NIa-Pro、pROKⅡ-NIb、pROKⅡ-CP及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。 3.叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草34株,转NIa-Vpg的烟草126株,转NIa-Pro的烟草101株,转NIb的烟草100株,转CP的烟草132株。 4.以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草,对转基因植株进行了抗病性分析。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVY的抗性存在着差异。在126株转NIa-Vpg的T代烟草中,有82株表现高度抗病,抗性植株比例为65.08%;101株转NIa-Pro的T代烟草中,有59株表现高度抗病,抗性植株比例为58.42%;100株转NIb的T代烟草中,有43株表现高度抗病,抗性植株比例为43.00%;132株转CP的T代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为63.64%。 5.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在rna水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为rna介导的抗病性,是rna沉默的结果。 6.转基因植株sirna的杂交分析显示,抗病植株中均检测到sirna的存在。

关键词：马铃薯Y病毒 NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CP rna介导的病毒抗性 hprna

水稻条纹病毒CP、NS3、SP、NSvc4基因介导的病毒抗性比较研究

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水稻条纹病毒CP、NS3、SP、NSvc4基因介导的病毒抗性比较研究

作者：于雪燕山东农业大学

学位级别：硕士

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引发的水稻条纹叶枯病是一种水稻生产上作用范围广,危害严重的病毒病。rna介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)。最新的研究证明发生于不同物种上的RN... 详细信息

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引发的水稻条纹叶枯病是一种水稻生产上作用范围广,危害严重的病毒病。rna介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)。最新的研究证明发生于不同物种上的rna沉默的直接引发因子都是双链rna(double strand rna)。在转基因植物研究中,dsrna形成的一条有效途径就是将体外构建的hprna结构(hairpin rna)cDNA引入植物。本研究构建了4个含有RSV不同功能基因发夹rna(hprna)结构的植物表达载体(转录后形成双链rna),利用农杆菌介导法转化水稻,对获得转基因植株进行水稻条纹病毒抗性鉴定,比较RSV外壳蛋白基因CP、特异性蛋白基因SP、非特异性蛋白基因NS3及运动相关蛋白基因NSvc4在rna介导的病毒抗性方面的差异。具体结果如下:1、以RSV的CP、NS3、SP和NSvc4基因3′端的400bp为目的片段,分别反向重复插入到含有经过改造的植物表达载体pCAMBIA-1300'中,构建了发夹结构植物表达载体pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4。2、将所构建的植物表达载体pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4及空载体pCAMBIA1300’用冻融法导入农杆菌EHA105。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功正确导入农杆菌中。3、农杆菌介导法转化水稻品种豫粳6号。经卡那霉素对再生植株进行抗性筛选,后经PCR检测,分别获得转pPHD-CP的水稻68株,转pPHD-NS3的水稻70株,转pPHD-SP的水稻57株,转pPHD-NSvc4的水稻58株和转pCAMBIA-1300'的水稻75株。4、以灰飞虱为传毒介体,对上述水稻受体进行常规生物学接毒,并进行了抗病性分析。统计测定结果显示,在转pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4的水稻中,RSV抗性植株的比例分别为32.73%、30.00%、38.56%和31.67%。5、Northern blot和sirna blot分析结果显示,转基因在rna水平上都得到了表达,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关;转基因植株中可以检测到病毒特异sirna,证明该抗病性是rna介导的抗病性,即rna沉默的结果,但抗病性与sirna的积累量二者并无直接关系。

关键词：水稻条纹病毒功能基因 rna介导的病毒抗性 ihprna

马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性的比较研究

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马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性的比较研究

作者：刘静山东农业大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(Potata virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种,对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重,特别是PVY坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝产。rna介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene sil... 详细信息

马铃薯Y病毒(Potata virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种,对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重,特别是PVY坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝产。rna介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS),是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略。它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的基因沉默,不但能将转基因的转录产物降解,而且能将入侵的与转基因同源的病毒基因组rna降解,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久及生物安全性高等优点。马铃薯Y病毒各基因编码的产物在病毒的复制和增殖过程中,表现为不同的功能,因此推测不同的功能基因介导的病毒抗性可能存在差异。目前病毒的衣壳蛋白基因、复制酶基因和移动蛋白基因等均有rna介导抗性的报道,但尚缺少系统的比较研究。本研究采用RT-PCR技术,克隆马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的P1、HC-Pro、P3、CI基因,进一步亚克隆了P1、HC-Pro、P3、CI基因的3’端cDNA区段,构建茎长度400bp、环长度为100bp的hprna结构植物表达载体,转化烟草,进行抗性鉴定。研究结果表明马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性存在比较明显的差异。具体结果如下:1. Trizol法提取感染PVY的烟草叶片的总rna,采用RT-PCR的方法克隆了马铃薯Y病毒基因组P1、HC-Pro、P3、CI 4个基因片段。序列已登录GenBank,登录号为:EU182576。2.以P1、HC-Pro、P3、CI基因区段cDNA为模板,PCR分别扩增各基因3’端400bp和500bpcDNA区段,以pROKII为载体构建了茎长度为400 bp、环长度为100bp的hprna结构的植物表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3和pROKⅡ-CI。3.将所构建的表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3、pROKⅡ-CI利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明重组质粒均已成功导入农杆菌菌株。4.叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得转pROKⅡ烟草40株(对照),转pROKⅡ-P1烟草90株、转pROKⅡ- HC-Pro烟草108株、转pROKⅡ- P3烟草94株、转pROKⅡ-CI烟草96株。5.以感染PVYN烟草叶片的汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。通过症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性比例存在差异。在90株转pROKⅡ-P1的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为60.00%;在108株转pROKⅡ- HC-Pro的T0代烟草中,有36株表现高度抗病,抗性比例为33.33%;在100株转pROKⅡ- P3的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为57.45%;在96株转pROKⅡ-CI的T0代烟草中,有51株表现高度抗病,抗性比例为53.13%。6.转基因植株的Northern blot分析显示,转基因都在rna水平上得到了表达,抗病性与转基因转录的积累量二者之间呈负相关。转基因植株sirna的Northern blot分析显示,抗病的转基因烟草表现特异的杂交带,而转空质粒pROKⅡ的烟草没有杂交带。表明转基因烟草的抗病性是由rna介导的病毒抗性所产生的。

关键词：马铃薯Y病毒 rna介导的病毒抗性 P1、HC-Pro、P3、CI基因 hprna