检索结果-南通市图书馆

作者：王明慧苏州大学

学位级别：硕士

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族，参与调节生物体内多种生理反应。为深入研究丝氨酸蛋白酶抑制剂及互作因子在家蚕免疫防御中的作用机制，本文以家蚕为材料，做了如下研究：以脂肪体cDNA为模板克隆了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin-3)基... 详细信息

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族，参与调节生物体内多种生理反应。为深入研究丝氨酸蛋白酶抑制剂及互作因子在家蚕免疫防御中的作用机制，本文以家蚕为材料，做了如下研究：以脂肪体cDNA为模板克隆了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin-3)基因。利用原核表达系统表达了Bmserpin-3的编码区，并纯化了表达产物，利用纯化的蛋白，研究了Bmserpin-3参与家蚕黑化作用的机理;采用His-pull down技术筛选了与家蚕serpin-3相互作用蛋白;用RNAi结合荧光定量PCR的方法研究了Bmserpin-3对靶标蛋白的调控。主要研究结果如下： 1家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3基因的克隆本实验以家蚕幼虫脂肪体cDNA为模板，扩增获得了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3的基因序列(GenBank登录号NP01040318.1)。克隆的家蚕serpin-3基因开放阅读框含1311bp，编码458个氨基酸，预测蛋白质分子量约为49.33kD，等电点约为5.28，信号肽是前22个氨基酸残基，395-416是预测的活性位点，410位的Lys是预测的P1位点。 2家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3基因的原核表达将Bmserpin-3的编码区克隆到表达载体pET-28a(+)，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经0.5mmol/L IPTG诱导进行原核表达。SDS-PAGE电泳分析表明，转化了serpin-3重组载体的BL21菌，在约49kD位置出现了特异性条带，而对照组BL21菌、空pET-28a(+)转化的BL21菌、非诱导转化去信号肽的pET-28a-Bmserpin-3重组菌与诱导转化去信号肽的pET-28a-Bmserpin-3重组菌在同一位置则没有出现此特异条带，说明Bmserpin-3在大肠杆菌中得到表达，并对其进行了纯化。 3家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3参与黑化作用家蚕serpin-3与果蝇、烟草天蛾、冈比亚按蚊参与黑化作用的serpin序列比对，发现它们的同源性很高。用LPS诱导后不同时间分别测定serpin-3的蛋白浓度和PO活性，发现其浓度在LPS处理后较对照有所增加，PO活性升高，而在添加Bmserpin-3后，PO活性则有所降低，且随着添加Bmserpin-3剂量的增加，其PO活性受抑制更明显，说明Bmserpin-3抑制黑化作用。 4家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3相互作用蛋白的研究利用透析纯化技术将获得的原核表达重组融合蛋白进行纯化，经SDS-PAGE检测，纯化蛋白分子量大小与预测的一致，且目的蛋白纯度很高，以此蛋白作为诱饵蛋白，用His pull-down方法筛选了与家蚕血液中serpin-3相互作用的蛋白，经质谱分析，相互作用蛋白为家蚕储存蛋白(silkworm storage protein)，性别特异储存蛋白2(sex-specific storage-protein2precursor)，主要参与免疫，细胞凋亡等。 5家蚕serpin-3靶标蛋白的研究设计3对siRNA片段，转染家蚕卵巢细胞BmN，筛选获得干扰效果显著的片段。并将有效片段转染家蚕五龄第三天幼虫后用荧光定量PCR方法检测Bmsp2，3的表达量。结果显示，经Bmserpin-3干扰后，Bmsp2表达量显著下降，而Bmsp3表达量有所下降但不显著。推测Bmserpin-3或许能通过降低Bmsp2的mRNA水平从而引起sp2蛋白水平下降，而Bmsp3在mRNA的水平变化不大，说明Bmserpin-3没有影响Bmsp3的mRNA水平，可能在转录后翻译及翻译后水平参与了对sp3蛋白表达的调控。本文成功克隆了家蚕serpin-3基因并进行了原核表达，利用纯化的表达蛋白，鉴定了其相互作用蛋白，研究发现seripin-3参与免疫黑化反应。

关键词：家蚕 serpin-3基因 pull-down RNAi 黑化作用

鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白S13和L4与RNase E互作机制

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鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白S13和L4与RNase E互作机制

作者：秦秀秀华中农业大学

学位级别：硕士

生物体中RNA的加工和降解主要由多种核糖核酸酶共同完成,其中RNase E在大多数革兰氏阴性菌中作为RNA降解复合体的核心组分与其他的核糖核酸酶组成RNA降解复合体,进而参与RNA代谢和基因转录后的调控。核糖体蛋白除了在翻译过程中发挥主... 详细信息

生物体中RNA的加工和降解主要由多种核糖核酸酶共同完成,其中RNase E在大多数革兰氏阴性菌中作为RNA降解复合体的核心组分与其他的核糖核酸酶组成RNA降解复合体,进而参与RNA代谢和基因转录后的调控。核糖体蛋白除了在翻译过程中发挥主要功能外,还有RNA binding、核酸内切酶活性、抑制自身m RNA剪接等功能。并且,相关研究表明核糖体蛋白可以通过与大肠杆菌中RNase E的结合而抑制其酶活性。目前,RNA降解复合体在大肠杆菌中已有较为深入的研究,然而在鱼腥蓝细菌PCC 7120(Anabaena *** 7120)中RNA降解复合体的组成和功能尚未研究清楚,特别是核糖体蛋白与RNA降解复合体组分的相互作用研究甚少。本课题组前期通过体内共纯化实验鉴定到鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白L4和S13均能够与RNase E互作,但是并未对互作机制以及互作的生理生化意义进行深入分析。本研究首先构建了鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白L4和S13的异源表达载体,并通过Ni柱亲和层析纯化得到这两种核糖体蛋白。然后,通过Far-Western Blotting实验和pull-down实验进一步验证了核糖体蛋白L4和S13与RNase E的互作。此外,以大肠杆菌中相应的核糖体蛋白L4和S13作为参考,进一步通过生物信息学的方法分别对与蓝细菌中L4和S13蛋白序列同源性较高的物种进行了序列比对,并根据序列保守性将鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白L4和S13进行了区段划分,构建了相应区段缺失的截短蛋白。同样通过Far-Western Blotting实验确定核糖体蛋白L4的N端主要参与了和RNase E的互作,然而,值得注意的是,这与大肠杆菌中鉴定到的L4与RNase E的C端存在互作有一定差异,推测这可能是蓝细菌中特有的一种互作模式。最后,体外酶活实验表明鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白L4和S13均不会对RNase E产生明显的抑制效应,进一步说明蓝细菌与大肠杆菌之间在RNA代谢调控上的差异。本研究首次确定了鱼腥蓝细菌PCC 7120中核糖体蛋白和RNase E的互作机制,并对其生理生化功能进行了初步探究,研究结果为进一步揭示鱼腥蓝细菌PCC 7120中RNA的降解机制奠定了理论基础。

关键词： RNA降解复合体鱼腥蓝细菌PCC7210 RNase E 核糖体蛋白 Far-Western Blotting pull-down 相互作用

鸡Ii与B-L基因表达产物的细胞定位与结合活性特征的研究

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鸡Ii与B-L基因表达产物的细胞定位与结合活性特征的研究

作者：罗兰芳安徽农业大学

学位级别：硕士

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是由一群位于脊椎动物特定染色体区域基因所编码的高度多态性蛋白分子。MHC分子分布于不同细胞表面,通过呈递抗原来调节免疫应答。不同种动物的MHC及其对应编码产物的名称... 详细信息

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是由一群位于脊椎动物特定染色体区域基因所编码的高度多态性蛋白分子。MHC分子分布于不同细胞表面,通过呈递抗原来调节免疫应答。不同种动物的MHC及其对应编码产物的名称各不相同。MHC分子家族中的II类分子是由α、β两条链组成的异二聚体。在内质网中,它与自己的γ链聚合,形成九聚体。因为γ链不同于α和β链,呈非多态性,因此称恒定链(Invariant chain,Ii)。作为MHC II分子的重要伴侣蛋白分子,Ii辅助MHC II分子的正确折叠、组装、结构维持和协助呈递外源性抗原肽。在与MHC II分子的α、β链形成九聚体的过程中,其CLIP区(the class-II associated Ii chain peptide)占据MHC II类分子的抗原结合槽,阻止内源性抗原肽与MHC II类分子结合。Ii与MHC分子的相互作用主要通过真核细胞和原核细胞表达系统进行研究。在真核表达中,通过共转染动物细胞表达,再用激光共聚焦和免疫共沉淀实验观察Ii与MHC分子的相互关系。由于在这两个分子间关系中,需要检测分子间亲和力关系,但是现有的动物真核细胞表达产物难以满足这类实验。为此,本研究探索应用原核表达系统大量表达目的蛋白,以此研究两种分子间的相互作用。首先,根据GenBank鸡Ii(登录号:AY597053)、B-LA(AY357254)和B-LB(S66480)基因序列,利用自行设计的引物,从实验室保存的各基因cDNA克隆鸡的Ii、B-LA和B-LB全长编码区域,将克隆的基因片段分别插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-28a,以及真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1中,分别用于转化大肠杆菌Rosetta(DE3)和转染真核细胞表达真核蛋白。经PCR、重组质粒双酶切鉴定和测序鉴定,结果表明成功构建6个重组质粒。其次,将原核表达产物分别经反复冻融和超声裂解处理,GST-Ii蛋白经GST亲和层析柱(Glutathione Sepharose 4B)进行蛋白纯化,His/B-LA和His/B-LB经镍柱进行纯化。在SDS-PAGE电泳中,GST-Ii蛋白分子量为50.8 kD,His/B-LA蛋白分子量为34.1 kD,His/B-LB蛋白分子量为35.3 kD,GFP-Ii蛋白分子量为54.17 kD,GFP-B-LA蛋白分子量为54.84 kD,GFP-B-LB蛋白分子量为56.04 kD,与预期大小一致。用这些蛋白复性后分别免疫小鼠,获得特异性抗体。再用进行经真核表达的相应蛋白作为免疫印迹检测抗原,结果表明这些原核表达产物所诱导产生的抗体能识别和真核表达蛋白。再次,将重组质粒pEGFP-C1-C-Ii,pEGFP-N1-B-LA或pEGFP-N1-B-LB分别转染293T细胞,观察它们在真核细胞中表达以及表达产物在细胞内的定位。结果表明,它们均能在细胞内表达,并分布于浆膜系统。最后,为检测原核表达的Ii、B-LA和B-LB具有互相结合的功能,将pGEX-4T-1-C-Ii与pET-28a-B-LA或pET-28a-B-LB共转染工程菌,经诱导表达和复性后,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析提取结合的复合物。结果表明,共表达产物经亲和柱提纯后,在未经SDS处理的PAGE中,出现复合物Ii/B-LA和Ii/B-LB,再用SDS处理并进行电泳,发现在SDS-PAGE中这些复合物被解离成相应的2个单体条带。上述这些结果表明,鸡Ii和B-L基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性,而原核共表达的Ii和B-L蛋白分子复性后在pull-down中表明它们互相结合。本研究的结果为进一步研究Ii与B分子关系提供方法。

关键词：鸡恒定链 B-L 原核表达 pull-down

干旱胁迫下小麦脱水素WZY1-2、WZY2互作蛋白的筛选

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干旱胁迫下小麦脱水素WZY1-2、WZY2互作蛋白的筛选

作者：齐玉红西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦是重要的粮食作物,在生长过程中经常遭受环境因素,如干旱、高温、盐渍和重金属的影响,致使其严重减产。LEA蛋白作为植物遭受逆境胁迫的诱导蛋白,可以减轻植物细胞受到的损害,从而对植物起到保护作用。脱水素属于LEA蛋白第二亚家族成... 详细信息

小麦是重要的粮食作物,在生长过程中经常遭受环境因素,如干旱、高温、盐渍和重金属的影响,致使其严重减产。LEA蛋白作为植物遭受逆境胁迫的诱导蛋白,可以减轻植物细胞受到的损害,从而对植物起到保护作用。脱水素属于LEA蛋白第二亚家族成员,具有高度亲水性,在植物抵抗干旱胁迫中起到重要作用。本文以郑引1号小麦为材料,克隆得到WZY1-2、WZY2(小麦脱水素蛋白)基因,通过构建原核表达载体与诱饵载体,通过pull-down技术和酵母双杂交技术,筛选与脱水素WZY1-2、WZY2互作的蛋白,进一步研究该蛋白的功能。其结果为深入解析小麦抗旱的分子生物学机制、小麦分子育种等研究奠定基础。通过研究获得以下结果:1.从小麦郑引1号中克隆到脱水素基因WZY1-2、WZY2,基因编码区长789bp、459bp,分别编码262、152个氨基酸,蛋白质分子量为28KD、15.522KD,属于SK3、YSK2型脱水素。成功构建原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),通过诱导条件的筛选发现WZY1-2的最佳表达条件为在37℃下0.1mM的IPTG诱导6h,WZY2的为在37℃ 下0.2mM 的IPTG 诱导10h。***层析柱纯化WZY1-2、WZY2后,通过pull-down从小麦总蛋白中筛选到能与WZY1-2潜在互作蛋白有132个,其中96个为未知结构蛋白,36个为已知结构蛋白;与WZY2潜在互作蛋白有75个,其中68个为未知结构蛋白,7个为已知结构蛋白。选取与WZY1-2互作且与抗逆相关蛋白7个,与WZY2互作且与抗逆相关的蛋白6个,通过构建诱饵载体与猎物载体,在酵母菌株Y2HGold中进一步验证其互作。3.通过构建PGBKT7-WZY1-2、PGBKT7-WZY2载体,转化酵母菌株Y2HGold验证其自激活性与毒性作用,发现当AbA的浓度为200ng/ml时都能抑制酵母的本底表达,并且WZY1-2、WZY2在酵母中表达时对酵母无毒性作用。4.将cDNA文库转化含有PGBKT7-WZY2的Y2HGold酵母菌株中,通过检测其转化效率,发现达到8.7×106个单克隆,表明已将几乎全部的文库质粒转化进去。通过后续晒选实验,总共得到21个互作蛋白,其中有9个是与抗逆相关的蛋白,需要进一步在酵母中验证其互作性。

关键词：小麦脱水素 pull-down 酵母双杂

两个棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白质的筛选与鉴定

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两个棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白质的筛选与鉴定

作者：惠颖南京农业大学

学位级别：硕士

在我们以前的研究中,发现了两个棉花14-3-3蛋白质在野生型和棉花纤维发育突变体中差异表达。其中一个(EST为gi|78344446)在无絮棉突变体-3DPA胚珠中上调表达,另一个(EST为gi|78324056)在徐州142陆地棉0DPA胚珠中表达却在突变体0DPA胚珠... 详细信息

在我们以前的研究中,发现了两个棉花14-3-3蛋白质在野生型和棉花纤维发育突变体中差异表达。其中一个(EST为gi|78344446)在无絮棉突变体-3DPA胚珠中上调表达,另一个(EST为gi|78324056)在徐州142陆地棉0DPA胚珠中表达却在突变体0DPA胚珠中不表达。表明14-3-3蛋白可能在纤维发育过程中起到调控作用。14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的调控蛋白,主要通过与其它蛋白发生相互作用而发挥调控功能,因此探索14-3-3蛋白的功能应从研究与14-3-3蛋白互作的蛋白入手。本研究首先克隆了两个差异表达14-3-3蛋白质的编码基因全长,然后克隆到pET30原核表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达后用Ni-NTA树脂纯化出带有六联组氨酸标签的14-3-3蛋白。从徐州142、徐州142无絮突变体、TM-1和李氏纤维有限伸长突变体的-3、-1、0DPA胚珠和3、6DPA纤维中提取总蛋白并等量混合。以该混合蛋白为猎物蛋白质源,以两个14-3-3蛋白质为诱饵,分别进行pull-down试验,获得棉花胚珠与纤维总蛋白中与14-3-3蛋白互作的蛋白,双向电泳分离后进行质谱分析,鉴定14-3-3相互作用蛋白质,为进一步研究14-3-3蛋白在纤维发育中的作用打下了基础。主要研究结果如下： 1、根据EST序列(gi|78344446和gi|78324056),利用RACE技术,从陆地棉中克隆2个14-3-3蛋白编码基因全长,序列比对发现其中一个是新的棉花14-3-3蛋白家族基因,命名为Ghl4-3-3-like protein2(GenBank登录号：JF320796),另一个序列与Gh14-3-3b (GenBank登录号：EU189221)仅相差三个氨基酸,可能是同一个蛋白。 2、将两个14-3-3蛋白编码基因全长加上六联组氨酸标签并克隆至pET30原核表达载体上,IPTG诱导下,两个蛋白质均超量表达,SDS-PAGE电泳检测其分子量大约为30kD,与理论分子量一致。使用Ni-NTA镍柱纯化了这两个带6xHis标签的14-3-3蛋白。 3、分别以这两个蛋白质为诱饵,采用pull-down方法从-3、-1、0DPA胚珠,3、6DPA纤维提取的混合蛋白质中分离14-3-3的相互作用蛋白质。对分离的蛋白质进行双向电泳,MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定蛋白质点。发现了23个与Gh14-3-3-like protein2相互作用的蛋白,其中7个得到了鉴定,蛋白质功能涉及到胁迫反应、蛋白质代谢、核苷酸代谢,细胞骨架、跨膜运输、能量代谢、信号转导和其他功能。发现了29个与Gh14-3-3b发生相互作用的蛋白,其中16个得到了鉴定,这些蛋白质功能涉及到胁迫反应,蛋白运输定位、蛋白代谢、蛋白质构象、细胞骨架、14-3-3蛋白单体和其他功能。这些14-3-3互作蛋白的鉴定为深入解析14-3-3蛋白在棉花纤维初始发育的调控机理提供了线索。

关键词：棉花 14-3-3蛋白 RACE pull-down 蛋白质相互作用

苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位

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苹果褪绿叶斑病毒与苏俄苹果互作寄主因子的鉴定及亚细胞定位

作者：何乙坤河北农业大学

学位级别：硕士

苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是苹果上危害最大的一类潜隐性病毒,广泛分布于世界各地。该病毒单独侵染或与其它病毒混合侵染严重影响果树产量及果实品质,造成严重的经济损失。本研究在利用酵母双杂交技术... 详细信息

苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是苹果上危害最大的一类潜隐性病毒,广泛分布于世界各地。该病毒单独侵染或与其它病毒混合侵染严重影响果树产量及果实品质,造成严重的经济损失。本研究在利用酵母双杂交技术筛选能与ACLSV CP、MP互作的苏俄苹果寄主因子的基础上,通过生物信息学分析,从中选取可能具有重要功能的寄主因子。利用酵母双杂交、pull-down技术进行进一步互作验证。然后,对ACLSV功能基因CP、MP及互作寄主基因Malus15-1进行了亚细胞定位。本研究结果将为揭示寄主基因在ACLSV侵染过程中具有的生物学功能及两蛋白互作的意义奠定基础。主要研究结果如下:1.利用酵母双杂交技术验证了苏俄苹果寄主因子Malus15-1、Malus40-5与ACLSV CP、MP的互作。首先,构建带有完整寄主基因Malus4-1、Malus15-1、Malus40-5、Malus72-3、Malus 85-1、Malus86-1的酵母双杂交表达载体。然后,利用共转化法将诱饵载体p GBKT7-CP、p GBKT7-MP与带有上述6种寄主基因的酵母表达载体转化至酵母菌株Y2H gold中,将共转化产物涂布于四缺(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)培养基上,观察酵母的生长及显色情况,验证寄主功能基因与寄主基因之间的互作。结果表明寄主因子Malus15-1、Malus40-5在四缺平板上菌落呈明显蓝色,证明CP、MP与寄主因子Malus15-1、Malus40-5互作。2.利用pull-down技术验证了ACLSV CP、MP与寄主因子Malus15-1之间的相互作用。首先,构建原核表达载体p ET28a-CP、p ET28a-MP、p ET28a-15-1和p ET28a-40-5,然后将重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,并诱导表达目的蛋白。采用pull-down方法,将洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot检测蛋白间的互作。结果表明,以CP为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有21.5 k Da、16 k Da两条明显条带;以MP蛋白为诱饵捕获Malus15-1蛋白,洗脱产物中有50.8 k Da、16 k Da两条条带,证明CP、MP与Malus15-1之间存在直接相互作用。同样分别以CP、MP为诱饵捕获Malus40-5蛋白,洗脱产物中仅有一条条带,证明CP、MP与Malus40-5蛋白之间无相互作用。3.揭示了ACLSV MP、CP及Malus15-1在本氏烟细胞中的定位情况。构建瞬时表达载体p Cam35s-gfp-CP、p Cam35s-gfp-MP及p Cam35s-gfp-15,利用液氮冻融法将重组载体转入农杆菌EHA105菌株,在供试本氏烟叶片下表皮注射农杆菌,利用激光共聚焦显微镜观测目的基因与GFP融合蛋白在本氏烟细胞中的定位情况:CP可能定位在细胞核和细胞质中,MP可能定位于细胞质和(或)内质网上,Malus15-1可能定位于细胞质中。

关键词：苹果褪绿叶斑病毒苏俄苹果酵母双杂交 pull-down 蛋白互作亚细胞定位

禾谷镰刀菌FgRab7功能及其调控网络初探

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禾谷镰刀菌FgRab7功能及其调控网络初探

作者：邓小龙福建农林大学

学位级别：硕士

禾谷镰刀菌是引起小麦、玉米等病害主要病原菌，由该病原菌侵染引起的减产和真菌毒素污染不仅影响小麦等农产品品质还对食品及饲料的安全构成威胁，因而在农业生产上备受关注。目前，对该病原菌的研究热点逐渐转向发现新药物作用靶点和... 详细信息

禾谷镰刀菌是引起小麦、玉米等病害主要病原菌，由该病原菌侵染引起的减产和真菌毒素污染不仅影响小麦等农产品品质还对食品及饲料的安全构成威胁，因而在农业生产上备受关注。目前，对该病原菌的研究热点逐渐转向发现新药物作用靶点和弄清其致病机理等方面。功能基因的研究是探索药物靶点的重要途径，本研究从具有分子开关作用的Ras家族中的Rab7基因的敲除入手，目的在于初步了解该基因在禾谷镰刀菌中的分子、细胞等水平的生物学功能，从而进一步了解该分子在菌丝生长、致病性、产孢、产毒素等方面的作用。结果发现，Rab7的敲除影响菌丝生长速度、毒素产量和产孢量。为进一步明确Rab7调控产孢和生长的机制，一方面，我们利用Hjs P u11一down的方法筛选与FgRab7直接互作的蛋白，并运用生物信息学方法与酵母数据库进行比对分忻。结果获得了一个可能跟DON毒素降解相关的酶（15—O一acetyltransferaseri3）和两个与孢子形成相关的蛋白。另一方面，我们对野生型和敲除突变体进行了蛋白组学分忻，结果显示，FgRab7的敲除对100多种蛋白产生影响，我们选取其中差异在三倍以上的43个蛋白点进行了质谱分忻，并随机抽取了其中的8个蛋白进行了转录水平的：Real—time PCR检测，发现这些基因的表达水平与蛋白水平一致。因此，我们认为FgRab7不仅调控孢子的形成、营养菌丝的生长，还参与DON毒素的合成分泌、代谢酶的表达。这为阐明Rab家族蛋白调控镰刀菌生长发育以及产孢机制，同时进一步为制定更加有效合理的赤霉病治理策略和措施奠定理论基础。

关键词：禾谷镰刀菌 Rab7 pull-down Real-time PCR 蛋白组学

草鱼免疫相关因子TAB1的转录表达模式及其与TAK1的互作验证

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草鱼免疫相关因子TAB1的转录表达模式及其与TAK1的互作验证

作者：刘心媛安徽农业大学

学位级别：硕士

蛋白质之间的相互作用（简称蛋白互作）是指两种或两种以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白互作构成了细胞生化反应网络的重要组成部分。因此,研究蛋白质之间的相互作用不仅可从分子水平揭示蛋白的结构与功能,而... 详细信息

蛋白质之间的相互作用（简称蛋白互作）是指两种或两种以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白互作构成了细胞生化反应网络的重要组成部分。因此,研究蛋白质之间的相互作用不仅可从分子水平揭示蛋白的结构与功能,而且为病原微生物的致病机理及动物疫病防控的研究提供新途径。转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。TAK1结合蛋白（TAK1-binding protein 1,TAB1）是一种广泛存在于无脊椎和脊椎动物细胞中的高度保守的免疫相关蛋白。目前已探明哺乳动物的TAB1通过与TAK1的互作参与调控多个细胞信号转导通路,在细胞分化、细胞凋亡和天然免疫应答中发挥重要作用。与哺乳动物相比,鱼类TAB1与TAK1蛋白互作研究起步较晚,仅见有大黄鱼TAB1与TAK1互作研究的文献报道。我们前期研究发现,拟态弧菌靶向核酸疫苗可显著增强草鱼肠黏膜免疫,免疫肠组织中CiTAB1基因显著上调并富集于多个天然免疫信号通路,但CiTAB1与CiTAK1之间是否存在互作关系尚不清楚。对此,本课题以CiTAB1为研究对象,分析CiTAB1基因在健康草鱼组织及免疫刺激前后细胞中的转录表达模式,确定CiTAB1蛋白的亚细胞定位及其与CiTAK1共定位情况。在此基础上,联合利用免疫共沉淀技术和pull-down试验验证CiTAB1与CiTAK1是否存在互作关系。主要研究内容与结果总结如下:1)CiTAB1基因的转录表达模式分析:论文中用TRNzol-A+总RNA提取试剂提取健康草鱼组织总RNA、反转录为cDNA,并以此为模板采用RT-qPCR检测CiTAB1基因在9种不同组织中的转录表达谱,结果发现该基因在各检测组织中广泛转录表达。随后,分别用脂多糖、肿瘤坏死因子-α和拟态弧菌疫苗抗原三种不同免疫刺激剂以不同浓度刺激草鱼肾细胞（CIK细胞）,采用RT-qPCR检测刺激前后不同时间CiTAB1基因的时序转录表达水平。结果表明,CiTAB1是一种免疫相关蛋白,三种免疫刺激剂均能刺激其转录表达水平显著上调,但时序变化水平依刺激物及其浓度的不同而异。2)CiTAB1蛋白亚细胞定位及其与CiTAK1共定位确定:论文中首先利用在线分析软件预测CiTAB1蛋白的亚细胞定位。然后,构建带有红色荧光标签的真核重组质粒pmCherry-C1-CiTAB1。最后,将pmCherry-C1-CiTAB1单转CIK与HEK293T细胞或与p EGFP-C1-CiTAK1共转HEK293T细胞,并经多聚甲醛固定细胞和DAPI染核后,在荧光显微镜下（400×）下观察荧光蛋白表达情况。结果显示,（1）预测到CiTAB1蛋白可能分布在细胞核中;（2）转染重组质粒pmCherry-C1-CiTAB1的CIK和HEK293T细胞的胞质与核胞核部位均发出红色荧光;（3）共转染pmCherry-C1-CiTAB1和p EGFP-C1-CiTAK1的HEK293T细胞中绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白重叠,在胞质中形成黄色荧光。结果表明CiTAB1蛋白分布在胞质与胞核中,并与CiTAK1在胞质中存在共定位。3)CiTAB1与CiTAK1的互作验证:论文中将pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-myc-CiTAK1或标签蛋白（pCMV-Myc,pmCherry-C1）共转染HEK293T细胞,以转染细胞裂解液与anti-Myc免疫磁珠进行免疫共沉淀,并通过免疫印迹检测蛋白间是否存在互作。结果显示anti-Myc单抗能从转染pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-Myc-CiTAK1以及pCMV-Myc-CiTAK1与pmCherry-C1的IP裂解液中检测到Myc-CiTAK1;anti-m Cherry单抗能从转染pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-Myc-CiTAK1的IP裂解液中检测到Cherry-C1-CiTAB1。结果表明CiT AB1与CiTAK1在细胞内存在互作关系。为了进一步验证上述两种蛋白是否能在体外直接结合,以纯化的His-CiTAB1融合蛋白为诱饵蛋白,CiTAK1为猎物蛋白进行His pull-down和免疫印迹检测。结果发现anti-His单抗可从转染细胞裂解液与重组蛋白或标签蛋白的混合物中检测到融合蛋白His-CiTAB1及His标签蛋白;anti-Myc单抗能从转染pCMV-Myc-CiTAK1的细胞裂解液与融合蛋白的混合物中检测到Myc-CiTAK1,但在与标签蛋白的混合物中未能检测到该蛋白。结果表明CiTAB1能与CiTAK1在体外直接结合。综上所述,CiTAB1基因在草鱼组织中广泛转录表达,免疫刺激剂可显著提高其

关键词：草鱼转化生长因子-β激活激酶1 草鱼TAB1蛋白转录表达模式亚细胞定位免疫共沉淀 pull-down

vp0610对副溶血性弧菌生物被膜形成调控机制的初步研究

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vp0610对副溶血性弧菌生物被膜形成调控机制的初步研究

作者：蒋富凤陕西科技大学

学位级别：硕士

副溶血性弧菌是一种广泛存在于温暖沿海水域的革兰氏阴性细菌,该菌可以通过不同途径感染人类,主要与食用被污染的海鲜食品有关。在海鲜等水产品的养殖过程中,通常伴随着各种抗生素和杀菌剂的使用,但是副溶血性弧菌仍然能够被检出,生物... 详细信息

副溶血性弧菌是一种广泛存在于温暖沿海水域的革兰氏阴性细菌,该菌可以通过不同途径感染人类,主要与食用被污染的海鲜食品有关。在海鲜等水产品的养殖过程中,通常伴随着各种抗生素和杀菌剂的使用,但是副溶血性弧菌仍然能够被检出,生物被膜被认为在水产品感染中发挥着重要作用。生物被膜能附着在生物及非生物介质表面,从而引起交叉感染。同时副溶血性弧菌形成生物被膜后具有较强抗逆性,使其具有一定程度的抗消杀能力,进而继续污染食品和食品加工设备。研究副溶血性弧菌生物被膜形成过程,为后续研究基于通路阻断的防控方法提供理论支撑,而目前关于副溶血性弧菌生物被膜形成的研究较少。因此,本研究对课题组前期通过蛋白质组学筛选出的生物被膜相关基因vp0610进行基因敲除以验证该基因功能,并结合pull down蛋白互作技术以及转录组学分析进一步挖掘vp0610在副溶血性弧菌生物被膜形成中的功能。主要研究结果如下:（1）生物信息学分析结果显示VP0610被注释为一个假定蛋白,由204个氨基酸组成,分子量为22.3 kDa,属于YfgM家族蛋白,目前在弧菌中均未发现该家族蛋白的任何报道。利用同源重组技术对vp0610进行基因敲除以及基因回补,并经测序验证成功获得vp0610的敲除株和回补株。结晶紫染色法定量分析表明:24 h前敲除株的生物被膜形成速度大于野生株,但24 h后敲除株的生物被膜形成量不再增加,而野生株的生物被膜形成快速增加,到72 h时,三者的形成量几乎一致,说明vp0610对早期生物被膜形成具有一定的抑制作用。激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对24 h的生物被膜形成做了进一步观察,证明敲除株的生物被膜形成量高于野生株。（2）通过测定影响生物被膜形成相关因素所对应表型以探究vp0610的作用途径发现:敲除株的游动能力明显大于野生株,说明vp0610对极鞭毛介导的游动能力具有抑制作用,当把vp0610敲除后,这种抑制作用被解除,极鞭毛的运动增加了菌株接触表面的可能性,使得生物被膜形成增加,但爬动能力没有明显差异;敲除株的可溶性多糖含量低于野生株,不可溶性多糖含量显著高于野生株。可溶性多糖通常充当能量物质,表明敲除株的生物被膜中菌体量大说明对能量的消耗也大,不可溶性多糖作为生物被膜的结构物质,其含量与生物被膜测定结果保持一致;c-di-GMP测定结果显示:vp0610对12 h的c-di-GMP产生没有显著影响,但是24 h后敲除株的c-di-GMP产生量显著降低,这解释了 24 h后敲除株的生物被膜形成缓慢增加甚至不再增加的原因。（3）找到VP0610在生物被膜形成中的功能后,本试验继续从蛋白层面研究VP0610的互作蛋白。pull-down结果显示:VP0610能与180个蛋白发生相互作用,这180个蛋白的GO富集分析发现它们主要参与RNA降解、代谢途径、核黄素代谢、次级代谢产物的生物合成、抗生素的生物合成,其中与生物被膜形成相关的互作蛋白主要涉及群体感应和PTS系统的组分。因此,初步认为VP0610主要通过这两条途径影响生物被膜形成。（4）通过RNA-Seq分析vp0610缺失后对基因转录调控的影响范围,发现12 h时敲除株与野生株相比有598个基因上调,639个基因下调,24h时有197个基因上调,115个基因下调。对这些差异基因进行GO功能富集分析发现:12 h时,显著富集到20个GO Term,主要涉及氧化还原过程、细胞氨基酸的生物合成过程、有机酸的生物合成过程、碳水化合物代谢及运输电子转移以及PTS系统等,PTS是生物被膜调控网络中的重要结构,该系统能够影响弧菌多糖、胞外多糖、c-di-GMP产生和降解以及Ⅳ型菌毛蛋白的表达;24 h时,虽然没有显著富集的GO Term,但是也能够富集到鞭毛依赖性细胞运动。鞭毛在生物被膜初期介导黏附定植,成熟期充当生物被膜支架。KEGG通路分析发现:12 h时显著富集的通路有11条,主要包含群体感应、果糖和甘露糖代谢、脂肪酸降解、碳源代谢和次级代谢产物的生物合成等,而碳源代谢使得胞外的可溶性多糖和不可溶性多糖增加;24 h时显著富集的通路有5条,主要包括缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸酯代谢、淀粉和蔗糖代谢、脂肪酸代谢和精氨酸生物合成。综上所述,VP0610能够通过作用于磷酸转移酶系统、群体感应系统等通路去影响副溶血性弧菌运动能力、胞外多糖和c-di-GMP产生等,进而负调控早期生物被膜形成。

关键词：副溶血性弧菌生物被膜形成 vp0610 pull-down 转录组测序分析

水稻条纹病毒抗性相关基因在大肠杆菌中的表达

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水稻条纹病毒抗性相关基因在大肠杆菌中的表达

作者：吴双首都师范大学

学位级别：硕士

水稻条叶枯病是危害水稻的一种主要的虫媒病害(Rice Stripe),它是由水稻条纹病毒(Rice stripe virus:RSV)引起的。在日本、朝鲜及我国都有过多次反复爆发,带来巨大危害。而水稻的栽培品种中的2个亚种对RSV表现出不同的抵抗性。一个亚种... 详细信息

水稻条叶枯病是危害水稻的一种主要的虫媒病害(Rice Stripe),它是由水稻条纹病毒(Rice stripe virus:RSV)引起的。在日本、朝鲜及我国都有过多次反复爆发,带来巨大危害。而水稻的栽培品种中的2个亚种对RSV表现出不同的抵抗性。一个亚种为*** ***,品质优良但抗病性差;另一个亚种为*** ***,品质差但抗病性强。实验发现Indica品种的粗分离物中有高活性的抑制RSV合成的抗性因子,经盐析、疏水及离子交换层析等分离,得到的组分仍然有高的抑制活性。目前已得到一条对RSV有抗性的相关基因,命名为s1。为了研究s1编码蛋白的功能,用大肠杆菌表达载体pET30a+,构建原核表达载体,进行蛋白的原核表达。SDS-PAGE电泳显示:经IPTG诱导,宿主大肠杆菌BL21(DE3)plys表达出了与其分子量大小(32kD)相同的目的蛋白。优化原核表达条件,通过设置时间梯度,发现6小时表达量达到最高;在诱导温度上,我们发现37℃下易形成包涵体,将温度降低到28℃,在不影响表达量的条件下,尽量减少包涵体的产生,最终形成可溶性蛋白。Western-blot进一步证实:目的蛋白得到了正确表达。我们选择pull-down的方法初步探索目的蛋白(S1)的作用。以S1蛋白作为“诱饵”蛋白,水稻全蛋白作为“猎物”蛋白,在体外大规模筛选能够和目的蛋白相互作用的水稻蛋白,以推测目的蛋白的具体作用。本论文利用原核表达系统成功地表达出了RSV抗性相关蛋白(S1),并发现水稻中确有蛋白能与目的蛋白结合、相互作用,为后续研究目的蛋白的具体功能打下了基础。

关键词：水稻条纹病毒 s1基因原核表达诱导 pull-down