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pkd2l1+触液神经元在脊髓损伤小鼠体内移植的实验研究

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Pkd2l1+触液神经元在脊髓损伤小鼠体内移植的实验研究

作者：罗张荣贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:探索pkd2l1触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-c Ns)能否在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)小鼠体内移植存活并发挥神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)作用。方法:体外:1、分离原代CSF-c Ns,通过流式细胞荧光分选术初步筛选原代CSF-c Ns,运用慢病毒转染并标记CSF-c Ns,嘌呤霉素筛选被慢病毒标记的CSF-c Ns,通过细胞免疫荧光技术检测经筛选纯化后的CSF-c Ns表达的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)与其特异性标记物pkd2l1荧光共表达情况,分析GFP在CSF-c Ns中的表达特异性;2、将筛选纯化后的CSF-c Ns体外悬浮培养成球并连续传代至15代,通过细胞免疫荧光技术检测传代15次后的CSF-c Ns特异性表达的GFP与其特异性标记物pkd2l1以及NSCs标记物Nestin、Sox2、GFAP荧光共表达情况,分析CSF-c Ns在体外的NSCs潜能;3、选取传代至15代的CSF-c Ns神经球,在体外诱导分化7天后,通过细胞免疫荧光技术检测CSF-c Ns特异性表达的GFP与成熟神经元标记物Neu N、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4荧光共表达情况,分析CSF-c Ns在体外的分化能力。体内:1、选取6-8周C57Bl/6小鼠,通过钳夹法建立SCI模型,立即移植预先准备好的CSF-c Ns到损伤区域两侧,在移植后3、7、14天取材,利用石蜡切片(5um)组织免疫荧光技术检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)的存活情况,以及CSF-c Ns(GFP阳性细胞)移植入体内后与NSCs标记物Nestin、Sox2、GFAP、CD133、EGFR共表达情况,并运用多重免疫组化技术进一步检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)与激活状态NSCs标记物Nestin、EGFR荧光三标情况,以及CSF-c Ns(GFP阳性细胞)与静息状态NSCs标记物GFAP、CD133荧光三标情况;2、在移植后3、7、14天向待取材小鼠体内注射Ed U溶液,利用石蜡切片组织免疫荧光技术检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)与增殖标记物Ed U、PCNA共表达情况,分析CSF-c Ns在移植入小鼠体内后的增殖能力;3、在移植后3、7、14天,利用石蜡切片组织免疫荧光技术检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)与未成熟神经元标记物βⅢ-tubulin、成熟神经元标记物Neu N、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4荧光共表达情况,分析CSF-c Ns在体内的分化能力,同时检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)与GABA荧光共表达情况,验证CSF-c Ns是GABA能神经元;4、建立脊髓半横断损伤小鼠模型,在移植CSF-c Ns后3、7、14天取材,利用石蜡切片组织免疫荧光检测CSF-c Ns(GFP阳性细胞)在SCI区域的聚集情况,分析CSF-c Ns在移植入体内后对于脊髓缺损区的修复能力。结果:体外:1、CSF-c Ns在体外成功筛选纯化且表达的GFP与其特异性标记物pkd2l1高度共表达(p2、传代15次后的CSF-c Ns依然表达pkd2l1以及NSCs标记物Nestin、Sox2、GFAP,说明CSF-c Ns在体外多次传代后依然保持NSCs潜能;3、CSF-c Ns特异性表达的GFP与成熟神经元标记物Neu N、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4荧光共表达,说明多次传代后的CSF-c Ns在体外仍具有分化能力。体内:1、移植后3、7、14天,CSF-c Ns均成功存活且在第7天存活细胞数最高(p2、GFAP、CD133、EGFR荧光共表达且均在第7天时的共表达细胞占比最高(p2、移植后3、7、14天,CSF-c Ns与增殖标记物Ed U、PCNA荧光共表达,说明CSF-c Ns在体内具有增殖能力;3、移植后第3天,CSF-c Ns与未成熟神经元标记物βⅢ-tubulin、GABA荧光共表达,但不与成熟神经元标记物Neu N、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4荧光共表达,移植后第7天,CSF-c Ns与未成熟神经元标记物βⅢ-tubulin、GABA、成熟神经元

关键词：触液神经元移植神经干细胞脊髓损伤 pkd2l1

pkd2l1+触液神经元促进脊髓损伤修复的作用研究

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Pkd2l1+触液神经元促进脊髓损伤修复的作用研究

作者：张毅贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)后神经元发生不可逆性死亡,导致患者出现感觉、运动和自主神经功能障碍。脊髓中的神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)能够分化为新的神经元并促进脊髓损伤修复。我们前期研究表明pkd2l1触液神经... 详细信息

目的:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)后神经元发生不可逆性死亡,导致患者出现感觉、运动和自主神经功能障碍。脊髓中的神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)能够分化为新的神经元并促进脊髓损伤修复。我们前期研究表明pkd2l1触液神经元在体内、外均具有神经干细胞特性。因此,探究pkd2l1触液神经元能否促进脊髓损伤修复,将有助于我们进一步了解触液神经元的神经干细胞功能特性。方法:本实验采用四种实验小鼠:(1)6-8周龄的雌性普通C57Bl/6小鼠;(2)6-8周龄的雄性普通C57Bl/6小鼠;(3)6-8周龄的雌性C57Bl/6N-pkd2l1 em1cyagen基因敲除小鼠;(4)6-8周龄的雄性C57Bl/6N-pkd2l1 em1cyagen基因敲除小鼠,脊髓损伤后雌雄小鼠表现无明显差异。实验小鼠分为以下四组:(1)普通小鼠Sham组:仅打开T9-T11椎板,不钳夹脊髓;(2)普通小鼠SCI组:在打开T9-T11椎板后,用血管钳钳夹T10节段脊髓10秒;(3)pkd2l1基因敲除鼠Sham组:仅打开基因敲除鼠的T9-T11椎板,不钳夹脊髓;(4)pkd2l1基因敲除鼠SCI组:在打开基因敲除鼠的T9-T11椎板后,用血管钳钳夹T10节段脊髓10秒(n=6只/组)。利用石蜡切片免疫荧光检测pkd2l1与Nestin、Sox2、Dcx、βⅢtubulin、GFAP、Foxj1的共表达情况;利用石蜡切片免疫荧光观察各组小鼠脊髓损伤后pkd2l1与GABA、Gata2、Gata3、Nestin、Sox2、GFAP及Dcx的共表达情况。利用石蜡切片进行5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)染色,分析各组小鼠脊髓损伤后的Ed U阳性细胞数量。通过石蜡切片进行髓鞘固蓝(luxol Fast Blue staining)染色和尼氏(焦油紫法)染色,观察各组小鼠脊髓损伤后的髓鞘脱失和神经元损伤情况。使用石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色和马松(Masson)染色,观察各组小鼠脊髓损伤后损伤区域的空泡变性和胶质瘢痕形成情况。最后,通过Basso Mouse Scale(BMS)评分法评估脊髓损伤后各组小鼠的运动功能恢复状况。结果:***2l1触液神经元在体内表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2及不成熟神经元标记物Dcx、βⅢtubulin;同时,pkd2l1触液神经元还表达室管膜细胞标记物Foxj1;但pkd2l1触液神经元在体内不表达星形胶质细胞标记物GFAP。2.成功构建C57Bl/6N-pkd2l1 em1cyagen基因敲除鼠并通过基因型鉴定筛选出纯合子小鼠作为实验对象。利用石蜡切片免疫荧光发现pkd2l1基因敲除小鼠脊髓中三种触液神经元标记物GABA、Gata2、Gata3阳性细胞数量明显低于普通小鼠,且脊髓中Gata3阳性细胞几乎完全消失(Ppkd2l1基因敲除小鼠与普通小鼠相比,伴随着脊髓中触液神经元数量显著降低,脊髓中三种神经干细胞标记物Nestin、Sox2、GFAP阳性细胞数量同样明显减少(Ppkd2l1与细胞增殖标记物Ed U双标阳性细胞数量明显增加,同时脊髓中Ed U阳性细胞数量也显著升高。然而,与普通小鼠相比,pkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后脊髓中Ed U阳性细胞数量显著降低(Ppkd2l1与细胞迁移标记物Dcx双标阳性细胞数量明显增加,同时脊髓中Dcx阳性细胞数量也显著升高。然而,与普通小鼠相比,pkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后脊髓中Dcx阳性细胞数量显著降低(PlFB)染色显示,与普通小鼠相比,pkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后髓鞘脱失面积增多(Pl)染色显示,与普通小鼠相比,pkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后尼氏染色阳性细胞数量减少(Ppkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后空泡变性及炎细胞浸润增多(Ppkd2l1基因敲除小鼠脊髓损伤后胶原纤维沉积增多(Ppkd2l1基因,其BMS评分均在8-9分之间。普通小鼠和pkd2l1基因敲除小鼠在脊髓损伤后早期BMS评分均为0-1分,但随着损伤后时间的推移,pkd2l1基因敲除小鼠的BMS评分逐渐低于同时间点普通小鼠。结论:pkd2l1触液神经元在体内具有不成熟特性;pkd2l1触液

关键词：脊髓损伤 pkd2l1 触液神经元 NSCs 基因敲除

多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

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中国组织工程研究 2023年第34期27卷 5505-5509页

作者：罗张荣曹亮张毅皮文俊李青贵州医科大学临床医学院贵州省贵阳市550025 贵州医科大学附属医院创伤骨科贵州省贵阳市550004

背景:最近研究发现位于脊髓中央管附近的接触脑脊液神经元(简称触液神经元)具有神经干细胞潜能,但触液神经元在体外研究中纯度不高,且目前尚无体外示踪技术证明其神经干细胞特性。目的:通过多模态影像分子筛选并在体外验证触液神经元的... 详细信息

背景:最近研究发现位于脊髓中央管附近的接触脑脊液神经元(简称触液神经元)具有神经干细胞潜能,但触液神经元在体外研究中纯度不高,且目前尚无体外示踪技术证明其神经干细胞特性。目的:通过多模态影像分子筛选并在体外验证触液神经元的神经干细胞特性。方法:根据触液神经元特异性表达pkd2l1基因,针对pkd2l1基因上游启动子设计一种使触液神经元特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的多模态影像分子慢病毒(lentivirus-pkd2l1-GFP-puromycin-luciferase)。从出生24 h内C57Bl/6小鼠延髓组织中提取出原代神经干细胞贴壁培养,用多模态影像分子病毒转染含有触液神经元的原代神经干细胞,通过嘌呤霉素筛选并纯化触液神经元。对筛选纯化的触液神经元进行体外悬浮培养并连续传代4代以上,免疫荧光检测第3代触液神经元与神经干细胞标记物Nestin、Sox2共表达情况。通过对第3代触液神经元诱导分化培养,免疫荧光检测触液神经元与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4的共表达情况。结果与结论:成功构建出多模态影像分子慢病毒,并且筛选纯化后的触液神经元能够存活、增殖并表达绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白阳性触液神经元能在体外连续传代4代以上,并表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2。诱导分化后,绿色荧光蛋白阳性触液神经元表达神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4。结果表明:多模态影像分子病毒能特异性标记触液神经元,触液神经元在体外具有自我更新、多向分化能力,通过多模态影像分子在体外成功验证触液神经元具有神经干细胞特性。

关键词：触液神经元神经干细胞多模态影像分子慢病毒 pkd2l1

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pkdl通道的酸反应特性的电生理研究

PKDL通道的酸反应特性的电生理研究

作者：赵杰浙江大学

学位级别：硕士

背景和目的：TRPP是TRP家族中重要的一个亚家族。人们发现pkd2突变后会导致常染色体多囊肾疾病(ADpkd, autosomal dominant polycystic kidney disease)后,因此命名了TRPP。TRPP亚家族包括pkd1、pkd2、pkd2l1、pkd1l3、pkd2l2等等。其中的pkd1/pkd2形成的受体-通道复合物,是与细胞的机械敏感性紧密相联的。而TRPP的另外两个成员pkd1l3和pkd2l1组成的通道复合物与pkd1和pkd2组成的通道复合物非常相似,2006年有三个研究小组均在国际知名杂志发表论文,认为pkd1l3和pkd2l1是对酸味敏感的感受体。此文中的PDKl通道就指的是pkd1l3和pkd2l1组成的通道。在发现pkdl通道的对酸反应后,杨巍和陈培华首先验证了共同表达pkd1l3和pkd2l1后产生的内向电流不是一个延迟反应,而是一个off响应。然后研究off响应与给酸和撤酸溶液的pH的关系,最后还研究了off响应的Ca2+依赖性。尽管酸通道的具体编码酸味觉的机制还不是很清楚,但本文尝试着用电生理和工程学的一些方法对此进行一些解读。实验方法：HEK293细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中,3-4天传代一次,传代后24小时左右转染。转染时使用脂质体lipofectamine2000 (Invitrogen),一般每35 mm培养皿,加入3-4μg质粒。将GFP. pkd1l3和pkd2l1共同转染到HEK293细胞中,室温下(22-25℃)对转染后24-48小时的HEK293细胞在电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录。用Multiclamp700A放大器(Axon, USA)和pClAMP系统软件(Version 9.0, Axon, USA)进行电信号的放大以及数据的记录和分析。数据采集接口为Digidata 1322A (Axon, USA),采样频率为10 kHz,1 kHz滤波。将种在小玻片的细胞放置在持续灌流细胞外液(ECS)的记录槽中进行实验。HEK293细胞的钳制电压为-60 mV。不同外液进行切换时,采用快速溶液切换系统RSC-160 (Biologic Science Instruments,France)完成。结果：1.撤酸后的不同pH对off电流的衰减时间的影响没有明显差异。2.胞外Ca2+浓度对off电流的衰减时间有较大的影响。胞外Ca2+浓度0mM时,衰减时间可以近二十秒,而当Ca2+浓度达到10 mM以及以上时,衰减时间则小于5秒。3.胞内Ca2+浓度也对off电流的衰减时间有较大的影响。含有0.5 mM EGTA的内液产生的off电流从峰值返回基线最快,均小于1秒,而含有10 mM BAPTA的内液产生的电流衰减时间很长,可达到6秒左右,含有5 mM EGTA的内液的电流的衰减时间居中。它们三者之间有统计学显著差异,*ppkd2l1、pkd2均在给酸后有ofp向应。结论：pkdl通道的off电流不仅与所给酸的pH值有关,而且与撤酸后的pH值有关。pkdl通道受胞内外Ca2+浓度调节。单独转染pkd2l1、pkd2均在给酸后有off响应。

关键词： pkd2l1 pkd1l3 酸通道膜片钳全细胞记录

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接触脑脊液神经元的研究现状

世界最新医学信息文摘 2019年第6期19卷 98-99页

作者：陈立王硕李青贵州医科大学贵州医科大学附属医院创伤骨科

接触脑脊液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF—CNs)作为一种特殊类型中枢神经细胞,通过其树突或轴突穿过脑脊液-脑屏障并与脑脊液接触。它具有感受器、分泌、运输调节等功能,但因其缺乏特异分子标记物,使其研究受到... 详细信息

接触脑脊液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF—CNs)作为一种特殊类型中枢神经细胞,通过其树突或轴突穿过脑脊液-脑屏障并与脑脊液接触。它具有感受器、分泌、运输调节等功能,但因其缺乏特异分子标记物,使其研究受到一定阻碍。近期研究证实pkd2l1为其特异性标记物,并发现接触脑脊液神经元可能为神经干细胞来源之一,对于临床研究神经系统损伤修复具有重要意义。

关键词：接触脑脊液神经元 pkd2l1 神经干细胞