PKDL通道的酸反应特性的电生理研究

作     者：赵杰 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗建红;杨巍

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071006[理学-神经生物学] 

主      题：PKD2L1 PKD1L3 酸通道 膜片钳 全细胞记录 

摘      要：背景和目的：TRPP是TRP家族中重要的一个亚家族。人们发现PKD2突变后会导致常染色体多囊肾疾病(ADPKD, autosomal dominant polycystic kidney disease)后,因此命名了TRPP。TRPP亚家族包括PKD1、PKD2、PKD2L1、PKD1L3、PKD2L2等等。其中的PKD1/PKD2形成的受体-通道复合物,是与细胞的机械敏感性紧密相联的。而TRPP的另外两个成员PKD1L3和PKD2L1组成的通道复合物与PKD1和PKD2组成的通道复合物非常相似,2006年有三个研究小组均在国际知名杂志发表论文,认为PKD1L3和PKD2L1是对酸味敏感的感受体。此文中的PDKL通道就指的是PKD1L3和PKD2L1组成的通道。在发现PKDL通道的对酸反应后,杨巍和陈培华首先验证了共同表达PKD1L3和PKD2L1后产生的内向电流不是一个延迟反应,而是一个off响应。然后研究off响应与给酸和撤酸溶液的pH的关系,最后还研究了off响应的Ca2+依赖性。尽管酸通道的具体编码酸味觉的机制还不是很清楚,但本文尝试着用电生理和工程学的一些方法对此进行一些解读。 实验方法：HEK293细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中,3-4天传代一次,传代后24小时左右转染。转染时使用脂质体Lipofectamine2000 (Invitrogen),一般每35 mm培养皿,加入3-4μg质粒。将GFP. PKD1L3和PKD2L1共同转染到HEK293细胞中,室温下(22-25℃)对转染后24-48小时的HEK293细胞在电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录。用Multiclamp700A放大器(Axon, USA)和pCLAMP系统软件(Version 9.0, Axon, USA)进行电信号的放大以及数据的记录和分析。数据采集接口为Digidata 1322A (Axon, USA),采样频率为10 kHz,1 kHz滤波。将种在小玻片的细胞放置在持续灌流细胞外液(ECS)的记录槽中进行实验。HEK293细胞的钳制电压为-60 mV。不同外液进行切换时,采用快速溶液切换系统RSC-160 (Biologic Science Instruments,France)完成。 结果： 1.撤酸后的不同pH对off电流的衰减时间的影响没有明显差异。 2.胞外Ca2+浓度对off电流的衰减时间有较大的影响。胞外Ca2+浓度0mM时,衰减时间可以近二十秒,而当Ca2+浓度达到10 mM以及以上时,衰减时间则小于5秒。 3.胞内Ca2+浓度也对off电流的衰减时间有较大的影响。含有0.5 mM EGTA的内液产生的off电流从峰值返回基线最快,均小于1秒,而含有10 mM BAPTA的内液产生的电流衰减时间很长,可达到6秒左右,含有5 mM EGTA的内液的电流的衰减时间居中。它们三者之间有统计学显著差异,*p0.05。 4.单独转染PKD2L1、PKD2均在给酸后有ofp向应。 结论：PKDL通道的off电流不仅与所给酸的pH值有关,而且与撤酸后的pH值有关。PKDL通道受胞内外Ca2+浓度调节。单独转染PKD2L1、PKD2均在给酸后有off响应。