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Identification of chloroquine resistance pfcrt-K76T and determination of Pfmdr1-N86Y copy number by SYBR Green I qPCR

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Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2015年第3期5卷 208-220页

作者： Addimas Tajebe Mulugeta Aemero Kimani Francis Gabriel Magoma Pan African University Institute for Basic Sciences Innovation and Technology JKUAT University of Gondar Kenya Medical Research Institute

Objective:To identify prevalence of chloroquine resistance point mutation at(pfcrt,K76T)and(Pfindr1.N86Y) copy number ***:SYBR Green I based real time PCR was *** hundred and thirty-three samples were analyzed for(pfcrt,K76T) and(Pfmdr1.N86Y) copy number from dried blood *** DNA was extracted using high pure DNA preparation *** amplification of DNA was done by using AccuPower 2* GreenStar '' qPCR Master *** quantification purpose a new primer pair was designed for 178 base pair template from complete genome sequence of Plasmodium falciparum strain 3D7 at *** quantification method was used to determine the Pfmdr1-N86 Y copy number *** curve was built from strain3D7 gDNA since it has single copy of Pfindr1 per haploid *** known positive controls with single and multi-copy number of Pfindr1 gene were included in each *** copy number ratio of the samples to the standard calibrator was made to obtain the fold difference among the samples with respect to copy number ***:Out of 133 samples 73(54.89%) were confirmed as mutant(pfcrt,76T) and the remaining 60(45.11%) were genotyped as wild type(pfcrt,K76).The(Pfindr1.N86Y) copy number variation was determined for 133 clinical *** of these samples 61(45.86%)had single copy and the remaining 72(54.14%) had multi-copy numbers higher than 1.5 copies per ***-four(25.56%) multi-copies were between 1.5 and 2.5 copies per genome while 38(28.57%) were more than 2.5 copies per *** minimum and maximum copies per genome were 0.474 and ***:The study showed high prevalence level and fixation of pfcrt.76 T mutation after chloroquine *** prevalence of Pfindr1 copy number variant suggested that the presence of modulating factor for emergence of Plasmodium falciparum strains with higher copy ***,the prevalence level was not statistically significant.

关键词： Plasmodium falciparum DNA copy number variation Pfmdrl pfcrt Real-time PCR

云南边境地区氯喹及与青蒿琥酯伍用治疗前后恶性疟原虫pfcrt和pfmdr1抗药性有关基因点突变的变化特征(英文)

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中国寄生虫病防治杂志 2003年第6期16卷 339-342页

作者：杨亚明 Adagu IS 张再兴 Warhurst DC 云南省寄生虫病防治所云南思茅665000 英国伦敦大学卫生与热带病学院

目的　了解氯喹单用及与青蒿琥脂伍用治疗恶性疟前后 ,pfcrt和 pfmdr1抗药性有关基因的点突变变化特征。　方法　使用PCR RFLP技术检测基因点突变。　结果　氯喹及与青蒿琥脂伍用治疗前后的所有样本都发现有恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸... 详细信息

目的　了解氯喹单用及与青蒿琥脂伍用治疗恶性疟前后 ,pfcrt和 pfmdr1抗药性有关基因的点突变变化特征。　方法　使用PCR RFLP技术检测基因点突变。　结果　氯喹及与青蒿琥脂伍用治疗前后的所有样本都发现有恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码 76突变为苏氨酸的特征。但是 ,氯喹治疗前 ,5 0 % pfmdr1基因氨基酸编码 86为天冬酰氨酸 (野生型 ) ,而剩余的 5 0 %为野生型和突变型 (苏氨酸 )的特征。氯喹治疗后 ,在 18个复燃的病例中 ,83 .3 %的 pfmdr1基因 86位点为野生型 ,剩余的 16.7%是混合型。氯喹与青蒿琥脂伍用治疗前 ,3个样本携带混合型基因型 ,剩余的 (86% )为野生型 ,但治疗后 ,所有样本只携带野生型。　结论　这些结果可能支持这样的假说 :pfcrt基因突变起主导作用 ,但 pfmdr1基因突变增强了氯喹抗药性的效果。

关键词：疟原虫恶性点突变云南氯喹青蒿琥酯治疗抗药性基因点突变 pfcrt pfmdr1 药物配伍

恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt研究进展

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中国血吸虫病防治杂志 2005年第3期17卷 231-233页

作者：王安平高琪江苏省寄生虫病防治研究所江苏省寄生虫分子生物学重点实验室江苏省寄生虫病学重点学科无锡214064

自从1959年第1例抗氯喹的恶性疟病人出现以来[1],恶性疟原虫氯喹抗药性(chloroquine resistance,CQR)已经遍及所有恶性疟流行地区,在东南亚地区CQR引发了更为严重的公共卫生问题,在我国云南、海南等省也有CQR恶性疟的流行.因此,对恶性... 详细信息

自从1959年第1例抗氯喹的恶性疟病人出现以来[1],恶性疟原虫氯喹抗药性(chloroquine resistance,CQR)已经遍及所有恶性疟流行地区,在东南亚地区CQR引发了更为严重的公共卫生问题,在我国云南、海南等省也有CQR恶性疟的流行.因此,对恶性疟原虫氯喹抗药性的研究已经成为当前疟疾防治研究中的一个重点.随着恶性疟原虫基因组研究的进展,抗药性基因已经成为CQR研究的热点.

关键词：恶性疟原虫性基因 pfcrt 公共卫生问题东南亚地区基因组研究流行地区防治研究抗药性抗氯喹第1例

恶性疟原虫:在旅游者中用氯喹加氯胍预防恶性疟原虫无效与pfcrt和二氢叶酸还原酶(DHFR)突变有关

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国外医学（寄生虫病分册） 2003年第4期30卷 188-189页

作者：王冬冬王晓黎

Polymorphic patterns of pfcrt and pfmdrl in Plasmodium falciparum isolates along the Thai-Myanmar border

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Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2013年第12期3卷 931-935页

作者： Phunuch Muhamad Wanna Chaijaroenkul Papichaya Phompradit Ronnatrai Rueangweerayut Pongsri Tippawangkosol Kesara Na-Bangchang Chulabhorn International College of Medicine Thammasat University Maesot General Hospital Department of Parasitology Faculty of MedicineChiang Mai University

Objective:To investigate the distribution and patterns of pfcrt and pfmdr1 polymorphisms in Plasmodium falciparum(***)isolates collected from the malaria endemic area of Thailand along Thai-Myanmar ***:Dried blood spot samples were collected from 172 falciparum malaria patients prior received *** samples were extracted using chelex to obtain parasite ***-RFLP was employed to detect pfert mutation at codons 76,220,271,326,3S6 and 371,and the pfmdr1mutation at codon ***1 gene copy number was determined by SYBR Green 1 real-time ***:Mutant alleles of pfcrt and wild type allele of pfmdrl were found in almost all *** gene copy number in isolates collected from all areas ranged from 1.0 to S.0 copies and proportion of isolates carrying>1 gene copies was 38.1%.The distribution and patterns of pfcrt and pfmdrl mutations were similar in *** isolates from all ***,significant differences in both number of gfmdr1 copies and prevalence of isolates carrying>1 gene copies were observed among isolates collected from different *** median pfmdr1 copy number in *** collected from Kanchanaburi and Mae Hongson were 2.5 and 2.0,respectively and more than half of the isolates carried>1 gene ***:The observation of pfindr1 wild type and increasing of gene copy number may suggest declining of artesunate-mefloquine treatment efficacy in *** isolates in this border area.

关键词： Plasmodium falciparum Multidrug resistance pfcrt Pfmdrl Gene mutation Gene copy number

河南省自赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2023年第5期41卷 593-600,608页

作者：周瑞敏纪鹏慧李素华杨成运刘颖钱丹邓艳鲁德领赵玉玲赵东阳张红卫河南省疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所河南省病原微生物重点实验室河南省寄生虫病与媒介医学重点实验室郑州450016

目的分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征。方法收集河南省2012—2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性... 详细信息

目的分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征。方法收集河南省2012—2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序。获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200和PF3D7_1324800)。使用SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析。结果2012—2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例。测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK13基因序列,基因突变率为8.8%(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C。测序获得91份恶性疟原虫样品的pfcrt基因序列,基因突变率为18.7%(17/91);检测出3种pfcrt基因型,分别为野生型C72V73M74N75K76(81.3%,74/91)、突变型C72V73I74E75T76(12.1%,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6%,6/91)。测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2%(71/92);检测出3个突变位点,分别为N86Y(41.3%,38/92)、Y184F(75.0%,69/92)和D1246Y(1.1%,1/92),其中N86Y突变率从2012年的68.8%(11/16)下降到2016年的11.1%(1/9)(χ2=11.58,P<0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8%,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1%,1/92)、N86F184D1246(34.8%,32/92)、N86Y184Y1246(1.1%,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2%,37/92)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7%(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1%,82/90)、C59R(93.3%,84/90)和S108N(96.7%,87/90);检测出5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3%,3/90),单基因突变型N51C59N108(2.2%,2/90),双重突变型I51C59N108(1.1%,2/90)、N51R59N108(3.3%,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0%,81/90)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8%(88/90);检测出6个突变位点,分别为I431V(8.9%,8/90)、S436A(27.8%,25/90)、A437G(92.2%,83/90)、K540E(3.3%,3/90)、A581G(1.1%,1/90)和A613S(2.2%,2/90);检测出8种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2%,2/90),单基因突变型I431A436A437K540A581A613(5.6%,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7%,60/90),双重突变型I431A436G437K540A581A613(10.0%,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3%,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9%,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1%,1/90)和I431A436G437K540A581S613(2.2%,2/90)。89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4%)同时发生双基因

关键词：恶性疟原虫药物抗性 PfK13 pfcrt Pfmdr1 Pfdhfr Pfdhps 赤道几内亚

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喹啉类抗疟药抗性机制研究进展

军事医学科学院院刊 2009年第1期33卷 71-73页

作者：王红王京燕军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目前对喹啉类药物抗性机制的研究引起了人们的普遍重视。本文综述了与抗药性有关的基因pfcrt,pfmdr1和cg2与喹啉类抗疟药抗性关系的研究进展。

关键词：氯喹喹啉抗性机制 pfcrt pfmdrl cg2

克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定

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克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定

作者：郝明明昆明医科大学

学位级别：硕士

目的：探索克钦邦佤邦恶性疟原虫pfcrt基因的多态性方法：1.应用Nest-PCR分别扩增MSP1、MSP2及Glurp基因中具有特异性的片段,进行基因分型,选出单一株。2.应用Nest-PCR扩增pfcrt基因上的两个片段,进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对... 详细信息

目的：探索克钦邦佤邦恶性疟原虫pfcrt基因的多态性方法：1.应用Nest-PCR分别扩增MSP1、MSP2及Glurp基因中具有特异性的片段,进行基因分型,选出单一株。2.应用Nest-PCR扩增pfcrt基因上的两个片段,进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果。结果：1.基因型鉴定：本实验通过对52株样本的MSP1、MSP2、GLURP进行基因型鉴定,获得39株单一感染细胞株。 2. pfcrt基因扩增结果：39株样本的pfcrt第71、72、74、75、76、77、97、144、148、152、160、163、194、220位点中,发现第71、72、74、75、76、220号位点存在突变,突变率分别为23.1%、23.1%、92.3%、89.7%、100.0%、100.0%;突变型为V71V、C72S、M74I、N75E、K76T、A220S;第77、97、144、148、152、160、163、194位点未见突变。结论：***1、MSP2、Glurp基因分型发现有39株样本是单一感染株,其中13株来自克钦邦,26株来自佤邦。 2.39株样本的pfcrt的71、72、74、75、76、220号位点存在突变。克钦邦样本CVIETS型的突变率明显高于佤邦(P=0.0031000nM)为严重抗药性虫株。氯喹的体外抗药性和pfcrt基因多态性有着密切的关系(P12.8nM)为抗性株;其中N11-966(IC50值>100nM)为严重抗性株。 3.奎宁：39株恶性疟原虫中有22/39(IC5o值500nM)为抗性株;其中F07-12(IC50值>2000nM)为严重抗性株。 4.青蒿琥酯：不同的参考标准对试验结论的影响较大。本文参考临界值计算公式结合加权法,得出其抗性临界值为29.6nM。39株恶性疟原虫中有38/39(IC50值40nM)为敏感性下降株。 5.双氢青蒿素：不同的参考标准对试验结论的影响本较大。本文参考药物体外抗性临界值计算公式(均数+2×标准差)结合加权法,得出其抗性临界值为7.7nM。39株恶性疟原虫中有37/39(IC5o值<7.7nM)对双氢青蒿素为敏感株;有2/39(ICso值≧7.7nM)为敏感性下降株。 6.交叉抗药性：经研究发现,对于中缅边境地区的恶性疟原虫而言,氯喹和哌喹二者之间,青蒿琥酯、双氢青蒿素及奎宁三者之间存在交叉抗药性。 7.克钦邦佤邦39株恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值的研究中发现：两地区样本均不同程度的对氯喹、哌喹和奎宁产生了抗性,且佤邦样本对氯喹、哌喹和奎宁抗性低于克钦邦样本;两地区样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性也不相同,且佤邦样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性大于克钦邦样本。目的：比较4℃冷藏同步化和山梨醇同步化这两种方法对体外测定药物IC50值的影响。方法：按照配对Hotelling T2设计,将8株恶性疟原虫分为两组,分别应用4℃冷藏同步化和山梨醇同步化处理,然后进行4种抗疟药(氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁)IC50值的测定。结果：4℃同步化后得到的8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素、奎

关键词：恶性疟原虫 MSP2 基因突变 pfcrt 抗疟药IC50值抗药性恶性疟原虫IC50值山梨醇同步化 4℃冷藏同步化

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寄生虫学

中国医学文摘（基础医学） 2005年第5期22卷 287-292页

0501961 用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究；0501962 恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析；0501963 恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的克隆与表达；0501964 抗恶性疟原虫谷... 详细信息

0501961 用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究；0501962 恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析；0501963 恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的克隆与表达；0501964 抗恶性疟原虫谷螽酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立；0501965 伯氏疟原虫RC株和N株感染小鼠IFN-γ mRNA的表达及其对致病的影响。[第一段]

关键词：恶性疟原虫海南株寄生虫学 EBA-175Ⅱ区胶体金免疫层析方法单克隆抗体基因检测 pfcrt IFN-γ 伯氏疟原虫