克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定

作     者：郝明明 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨照青

授予年度：2013年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：恶性疟原虫 MSP2 基因突变 pfcrt 抗疟药IC50值抗药性 恶性疟原虫IC50值山梨醇同步化 4℃冷藏同步化 

摘      要：目的：探索克钦邦佤邦恶性疟原虫pfcrt基因的多态性 方法：1.应用Nest-PCR分别扩增MSP1、MSP2及Glurp基因中具有特异性的片段,进行基因分型,选出单一株。2.应用Nest-PCR扩增pfcrt基因上的两个片段,进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果。 结果：1.基因型鉴定：本实验通过对52株样本的MSP1、MSP2、GLURP进行基因型鉴定,获得39株单一感染细胞株。 2. pfcrt基因扩增结果：39株样本的pfcrt第71、72、74、75、76、77、97、144、148、152、160、163、194、220位点中,发现第71、72、74、75、76、220号位点存在突变,突变率分别为23.1%、23.1%、92.3%、89.7%、100.0%、100.0%;突变型为V71V、C72S、M74I、N75E、K76T、A220S;第77、97、144、148、152、160、163、194位点未见突变。 结论：***1、MSP2、Glurp基因分型发现有39株样本是单一感染株,其中13株来自克钦邦,26株来自佤邦。 2.39株样本的pfcrt的71、72、74、75、76、220号位点存在突变。克钦邦样本CVIETS型的突变率明显高于佤邦(P=0.0031000nM)为严重抗药性虫株。氯喹的体外抗药性和pfcrt基因多态性有着密切的关系(P12.8nM)为抗性株;其中N11-966(IC50值100nM)为严重抗性株。 3.奎宁：39株恶性疟原虫中有22/39(IC5o值500nM)为抗性株;其中F07-12(IC50值2000nM)为严重抗性株。 4.青蒿琥酯：不同的参考标准对试验结论的影响较大。本文参考临界值计算公式结合加权法,得出其抗性临界值为29.6nM。39株恶性疟原虫中有38/39(IC50值40nM)为敏感性下降株。 5.双氢青蒿素：不同的参考标准对试验结论的影响本较大。本文参考药物体外抗性临界值计算公式(均数+2×标准差)结合加权法,得出其抗性临界值为7.7nM。39株恶性疟原虫中有37/39(IC5o值7.7nM)对双氢青蒿素为敏感株;有2/39(ICso值≧7.7nM)为敏感性下降株。 6.交叉抗药性：经研究发现,对于中缅边境地区的恶性疟原虫而言,氯喹和哌喹二者之间,青蒿琥酯、双氢青蒿素及奎宁三者之间存在交叉抗药性。 7.克钦邦佤邦39株恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值的研究中发现：两地区样本均不同程度的对氯喹、哌喹和奎宁产生了抗性,且佤邦样本对氯喹、哌喹和奎宁抗性低于克钦邦样本;两地区样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性也不相同,且佤邦样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性大于克钦邦样本。 目的：比较4℃冷藏同步化和山梨醇同步化这两种方法对体外测定药物IC50值的影响。 方法：按照配对Hotelling T2设计,将8株恶性疟原虫分为两组,分别应用4℃冷藏同步化和山梨醇同步化处理,然后进行4种抗疟药(氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁)IC50值的测定。 结果：4℃同步化后得到的8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素、奎