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p62dok-ptb结构域样新基因片段的克隆

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中国神经科学杂志 2000年第2期16卷 164-165页

作者：张勇陈哲宇黄爱军路长林周明明何成第二军医大学神经生物学教研室神经科学研究所上海200433 纽约大学Mount Sinai医学院生理与生物物理学系纽约10029

利用 RT- PCR方法 ,从胎儿脾脏和肝脏组织中克隆出一个 342 bp的基因片段 ,并测定了其核苷酸序列。在基因库中未见相同序列报道 ,但该片段与 p62 dok- ptb结构域核苷酸序列有 93%的同源性 ,提示它是一种新的 p62 dok- ptb结构域样基因... 详细信息

利用 RT- PCR方法 ,从胎儿脾脏和肝脏组织中克隆出一个 342 bp的基因片段 ,并测定了其核苷酸序列。在基因库中未见相同序列报道 ,但该片段与 p62 dok- ptb结构域核苷酸序列有 93%的同源性 ,提示它是一种新的 p62 dok- ptb结构域样基因片段。

关键词： p62dok ptb结构域基因片段克隆

大鼠Mint2 ptb结构域的原核表达与多克隆抗体的制备

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大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备

作者：陈雪梅郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的病因之一是脑内淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的产生和分泌，β来自脑内淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)。Mints(Munc18 interaction proteins)家族是一个接头分子家族，其家族成员中的Mint1和Mint2特异性表达于神经元中。许多研究表明Mints是调节APP代谢和Aβ产生的重要物质，被认为在阿尔茨海默病的病因、病理过程中发挥着极为重要的作用。 Mint2基因最初是在研究Mint1与APP的相互作用中被发现的。Mint2与APP结合可以调节APP的代谢和Aβ的产生。Mint2的ptb结构域与APP的C端YENPTY基序结合，抑制Aβ40的分泌，却不影响Aβ42的产生。当Mint2-APP复合体以Mint2的N端与XB51结合时，XB51-Mint2便从细胞膜转位到细胞浆中，XB51阻碍了Mint2-APP的结合，消除Mint2对Aβ40分泌的抑制作用。当Mint2的PDZ2结构域与单体NF-KB／P65 PHD域的161-FQV-163基序结合时，导致了Aβ42分泌水平的降低。因此，Mint2对Aβ分泌的抑制作用使其成为一个治疗AD的药物目标。为在分子水平上深入探索Mint2 ptb结构域在APP代谢过程以及信号转导中的作用，本研究利用重组DNA技术构建大鼠Mint2 ptb结构域的融合蛋白表达质粒，在大肠杆菌中进行了ptb结构域蛋白的原核表达，同时制备了抗大鼠Mint2 ptb结构域小鼠多克隆抗体。获得的蛋白和抗体便于今后用于转染细胞或原代神经元的免疫印迹以及免疫共沉淀的实验，为进一步的功能研究提供了可靠的实验工具。郑州大学2003年研究生毕业论文大鼠M功tZ ptb结构域的原核表达与多克隆抗体的制备方法1.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，P以)技术扩增大鼠肠ntZ ptb结构域片段:引物设计参照Genbank中大鼠MintZ ptb结构域的创ONA序列，利用DNAstar软件作为辅助工具，反应条件参照分子克隆略加改进。2.序列鉴定:使用双脱氧链终止法在上海基康公司进行DNA序列测序。3 .pGEX4T3一ptb重组质粒的获取:将PCR扩增片段和pGEX4T3载体分别用BamFa和Xhof双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，获得pGEx4T3一TB重组质粒。***4T3一TB重组质粒的扩增和鉴定:将pGEX4T3一，n3转化大肠杆菌TGI扩增后，进行质粒抽提，酶切鉴定。5.蛋白质表达和纯化:用pGEx碑T3一TB重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，正TG诱导表达后经15%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(***)检测GST一珊(Glutathiones一transformase，GST)融合蛋白，利用电泳凝胶成像分析系统对GST一扭融合蛋白进行分析，目的蛋白采用谷光甘肤一sePharose4B亲和层析柱进行纯化。6.P阳结构域抗体的制备与检测:用纯化的GST一珊融合蛋白直接免疫BA工B/C小鼠获得抗血清，用结合有GST的亲和层析珠去除抗GST的抗体，用交联有GST一TB的SePharose一4B珠纯化抗ptb抗体;采用酶联免疫吸附试验(E几刁me linkedimmuno一sorbent ass即，ELIsA)和蛋白质印迹(westem blot)法检测抗体的效价和特异性。结果1 .PcR扩增片段电泳结果:PcR扩增片段有一条亮带，在与Marker soobP对应处。***测序结果:所得片段长度为sl3bp，测序图第79位至591位碱基对应大鼠珑ntZ ptb的cDNA第1 320位至1 832位碱基。3 .pGEx4T3一TB重组质粒鉴定:双酶切产物经1%琼脂糖电泳后，有二条亮带，一条位于Marker soobp对应处，另一条大于Z000bp。

关键词：大鼠 Mint2 基因 ptb结构域大肠杆菌抗体阿尔茨海默病

Dok4和Dok5 ptb结构域融合蛋白的表达和纯化

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河南医学研究 2003年第2期12卷 100-103页

作者：阎志勇吴爱群张勇由振东路长林周明明何成郑州大学医学院解剖学教研室河南郑州450052 第二军医大学神经生物学教研室上海200433 纽约大学Mount Sinai医学院生理与生物物理学系纽约10029

目的 :制备Dok4和Dok5ptb结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5ptb结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST ptb融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sep... 详细信息

目的 :制备Dok4和Dok5ptb结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5ptb结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST ptb融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组的GST 4ptb和GST 5ptb融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度Dok4和Dok5ptb结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域 (ptb)

关键词： Dook4 Dok5 ptb结构域融合蛋白酪氨酸激酶受体大肠杆菌纯化

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Doksptb结构域与EGFR特异性结合

郑州大学学报（医学版） 2006年第3期41卷 509-511页

作者：阎志勇吴爱群张勇路长林何成郑州大学基础医学院人体解剖学教研室郑州450052 第二军医大学神经生物学教研室上海200433

目的:探讨Doks家族的ptb结构域在识别上游分子时的特异性。方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1ptb、GST4ptb和GST5ptb,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PT... 详细信息

目的:探讨Doks家族的ptb结构域在识别上游分子时的特异性。方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1ptb、GST4ptb和GST5ptb,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的ptb结构域能否与EGFR结合。结果:Dok1的ptb结构域,而非Dok4和Dok5的ptb结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合。结论:Doks家族的ptb结构域功能有差别,即ptb结构域在识别上游分子时具有特异性。

关键词： Doks ptb结构域谷胱苷肽-S转移酶共沉淀表皮生长因子受体

Cos-7细胞中Dok1抑制EGF诱导的膜皱褶的形成

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Cos-7细胞中Dok1抑制EGF诱导的膜皱褶的形成

作者：李治华郑州大学

学位级别：硕士

研究目的：酪氨酸激酶下游分子(Downstream of tyrosine Kinase，Dok)家族成员是一类存在于胞浆中的与酪氨酸激酶有关的信号转导分子，其中蛋白p62Dok(Dok1)可作为酪氨酸蛋白激酶(PTK)(v-Abl，v-Src，Tec和bcr-abl融合癌蛋白)或受体型PT... 详细信息

研究目的：酪氨酸激酶下游分子(Downstream of tyrosine Kinase，Dok)家族成员是一类存在于胞浆中的与酪氨酸激酶有关的信号转导分子，其中蛋白p62Dok(Dok1)可作为酪氨酸蛋白激酶(PTK)(v-Abl，v-Src，Tec和bcr-abl融合癌蛋白)或受体型PTK／RTK(EGFR、PDGFR、IR、Eph)的直接底物分子而被磷酸化。Dok1结构的N端包括一个pleckstrin的同源域(PH)和一个磷酸化酪氨酸的结合域(ptb)，它们分别被认为是Dok1与细胞膜和包含磷酸化酪氨酸的基序结合的结构域。Dok1还包括许多可被胞浆和RTKs磷酸化的一致的酪氨酸残基序列。如果这些酪氨酸残基发生磷酸化，它们会组成性的招募各种包含Src homology 2(SH2)结构域的信号分子，例如Ras GTP酶激活蛋白(rasGAP)、结合蛋白Nck和胞浆PTK Csk。因此Dok1的结构很像多位点的招募蛋白，例如胰岛素受体底物(IRS)，在PTK下游的细胞事件中起着关键的调节作用，例如IR通过IRS促进细胞的迁移。已有文献报道Dok1在应答EGF刺激时其酪氨酸残基被磷酸化，细胞中Dok1磷酸化的生理意义目前仍不太清楚。细胞黏附和胰岛素诱导的Dok1的磷酸化与细胞迁移有关，Dok1的磷酸化还可能决定了肿瘤细胞表型的获得，而几乎所有的肿瘤细胞中细胞骨架都有不同程度的改变。表皮生长因子受体(EGFR)激活的细胞中可观察到骨架改变的一种形态：背膜皱褶郑州大学2004年研究生毕业论文Cos一7细胞中Dokl抑制EGF诱导的膜皱褶的形成 (dorsal ruffle)，目前的分子生物学实验研究表明Doks的ptb结构域是其与RTK上磷酸化的酪氨酸残基结合的功能区。本研究欲从细胞学角度进一步搞清是否是ptb结构域介导了Dokl(RTK的底物)的下游信号转导作用，介导了细胞的生物学效应，包括细胞骨架形态的改变，变得有利于细胞的运动，甚至可能促进了细胞的迁移，这样不仅能够从细胞学的角度深入认识生物学效应的分子机制和信号分子Dokl的关键结构域在RTK下游信号转导中的重要作用，而且可为进一步探讨Dokl与某些肿瘤细胞表型获得的关系提供理论提示及实验方法的依据。深入研究其下游的信号转导机制还可为某些肿瘤转移的治疗提供新的思路，具有重要的理论意义及应用前景。方法:为进一步从细胞学的角度深入认识生物学效应的分子机制，信号分子Dokl的关键结构域在RTK下游信号转导中的重要作用，搞清是否是Dokl通过关键结构域，改变了细胞的形态骨架，以利于细胞的运动，促进了细胞的迁移，及其下游的信号通路。本实验采用重组DNA技术构建了YFP一Dokl，利用缺失突变和点突变的方法构建了YFP一Dokl的突变体(△PH，△ptb，R207A，R222A)。利用细胞转染的方法，将这些质粒在真核细胞中进行表达，利用细胞染色的方法，显示细胞形态骨架的改变。利用通路选择性抑制剂干扰法确定参与的信号通路，利用荧光显微镜显示表达荧光蛋白的细胞，并进行一系列观察、记数和统计分析。本研究的主要结果如下: 1.通过分析Dokl的结构及表达载体YFP的图谱序列，利用亚克隆的方法成功构建了YFP一Dokl及其突变体(△PH，△ptb，R207A，R222A)的质粒。 2.将构建好的质粒转染到Cos一7细胞中，待其表达后，用荧光显微镜观察发现Dok1WT的定位无特异性，在胞浆和胞膜均有分布，Dokl△PH只分布于胞浆，Dokl△ptb在胞浆、胞膜均有分布。验证了PH结构域与Dokl分子的膜定位有关，同时证明构建的质粒有效。 3.利用荧光显微镜实时观察的方法，将构建好的YFP一Dokl转染到C。S一7细胞中，发现无特异性发布的Dok1WT针对EGF的刺激，有明显的膜上聚集现象，并且利用通路选择性抑制剂干扰法证明了此通路是P工3K途郑州大学2004年研究生毕业论文Cos一7

关键词： Dok1 ptb结构域细胞骨架肌动蛋白膜皱褶

p52SHC3及其结构域对PC12细胞周期的影响

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p52SHC3及其结构域对PC12细胞周期的影响

作者：吕丹河北医科大学

学位级别：硕士

目的:SHC3蛋白属于Shc家族,Shc家族包括SHC1、SHC2、SHC3和SHC4四种蛋白。SHC1(又称ShcA或Shc)发现最早,在哺乳动物的组织中广泛表达,但不存在于成熟的神经元中;SHC2(又称ShcB)在神经系统中广泛存在,但在其他组织中不表达;SHC3(又称N-Sh... 详细信息

目的:SHC3蛋白属于Shc家族,Shc家族包括SHC1、SHC2、SHC3和SHC4四种蛋白。SHC1(又称ShcA或Shc)发现最早,在哺乳动物的组织中广泛表达,但不存在于成熟的神经元中;SHC2(又称ShcB)在神经系统中广泛存在,但在其他组织中不表达;SHC3(又称N-Shc、ShcC和Rai)只在成熟的神经元中表达,在其它组织中不表达;SHC4(又称ShcD)是新近发现的成员,在骨骼肌中表达,其它组织中的表达情况还不清楚。Shc家族都含有两种功能性结构域:能和磷酸化酪氨酸结合的ptb结构域和SH2结构域以及一个含有磷酸化酪氨酸的中央区域结构域CH1。ptb结构域和SH2结构域都可以和活化的酪氨酸激酶受体结合,CH1结构域则被认为可以和Grb2结合,参与下游的信号通路,也有人认为CH1结构域可以将Shc蛋白定位于细胞膜上,不经Grb2即可传递上游信号。SHC3蛋白有两种异构体,p66SHC3和p52SHC3,两者只是在N-末端不同。和p52SHC3相比,p66SHC3多了一个类似于中央区结构域的CH2结构域。有研究认为SHC3可以促进神经前体细胞的分化,维持神经前体细胞和神经元的存活,但是SHC3对可分裂细胞周期的影响还没有人研究过。本项研究旨在通过对p52SHC3及其结构域对PC12细胞周期的影响,探讨p52SHC3及其结构域对其它可分裂细胞周期的影响,进一步了解p52SHC3及其不同结构域的功能。方法:应用Western Blot技术验证SHC3在大鼠大脑、肺、肝和心脏等不同组织中的分布,将p52SHC3全长及其ptb结构域、SH2结构域、ptb+CH1结构域和CH1+SH2结构域插入载体pEGFP-N1中,构建其真核表达载体,使用脂质体转染的方法,将构建好的含有p52SHC3全长及其ptb结构域、SH2结构域、ptb+CH1结构域和CH1+SH2结构域的表达载体以及空载体转染进PC12细胞中,在转染后36h和60h,使用流式细胞术检测GFP阳性的细胞中G0/G1期的细胞所占的百分比。结果:p52SHC3在大鼠的大脑中表达量比较高,在大鼠的肺、肝和心脏中则没有表达;流式细胞术检测的结果显示,和转染空载的PC12细胞相比,转染p52SHC3全长的PC12细胞中,G0/G1期的细胞比例上升,转染ptb结构域和ptb+CH1结构域的PC12细胞中,G0/G1期的细胞所占的比例明显上升,而CH1+SH2结构域的PC12细胞中,G0/G1期的细胞所占的比例下降,转染SH2结构域的PC12细胞G0/G1期的细胞所占的比例无明显变化。结论:(1) p52SHC3全长可以抑制PC12细胞的增殖,ptb结构域和ptb+CH1结构域也可以将PC12细胞抑制在G0/G1期,CH1+SH2结构域则可以促进PC12细胞的增殖,SH2结构域对PC12细胞周期无明显作用;(2) p52SHC3有可能是通过其ptb结构域影响可分裂细胞的增殖;(3)ptb结构域对可分裂细胞周期的影响可能不经过CH1介导的信号通路,但CH1结构域的存在可以明显提高SH2结构域对可分裂细胞的增殖的促进作用。在p52SHC3中存在对细胞周期起截然相反的作用的两个结构域,这说明SHC3对细胞周期的影响是比较复杂的,进一步研究这两个结构域的功能将是非常有意义的。

关键词： SHC3 细胞周期 PC12细胞 ptb结构域 SH2结构域

靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治疗策略

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靶向性泛素化降解胰岛素样生长因子受体和胰岛素受体的肿瘤基因治...

作者：王秦豪第四军医大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚... 详细信息

胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor, IGF-1R)是受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族中的成员之一,在很多肿瘤细胞中,都存在IGF-1R的过度表达。IGF-1R是由位于胞外的α亚基和位于胞内的β亚基构成,两亚基以二硫键连接。其中α亚基负责与胞外配体结合,β亚基含有激酶催化结构域和多个磷酸化位点。当配体结合或因过度表达而导致受体活化时,β亚基胞内多个位点发生磷酸化,从而募集下游含有ptb结构域的胰岛素受体底物1/2(Insulin Receptor Substrate 1/2, IRS-1/2)等接头分子,进而激活下游MAPK和PI-3K等信号通路,促进细胞增殖、转移和侵袭,抑制细胞凋亡,加速肿瘤细胞的恶性转化。胰岛素受体(Insulin Receptor, InsR)作为细胞发生恶性转化的“帮凶”,与IGF-1R具有同样的胞内接头分子,介导相同的细胞信号通路,引起类似的细胞效应。因此,IGF-IR和InsR是抗肿瘤治疗的理想靶位。泛素化介导的蛋白质降解过程,是细胞内蛋白质负向调节的主要方式。泛素化反应过程是在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)的协同作用下,使被降解的蛋白发生泛素化,进而在蛋白酶体或溶酶体中降解。其中E3是蛋白质降解的关键连接蛋白,它能够特异性识别与结合底物,并将泛素转移至底物。本研究中利用具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域和Cbl的RING结构域行使降解功能,下调靶蛋白IGF-IR和InsR的水平,达到抑制肿瘤的目的。在本研究的第一部分实验中,我们通过重组PCR,将IRS-1蛋白中能够与磷酸化的IGF-IR和InsR结合的ptb结构域(Phosphotyrosine Binding domain)的基因与CHIP的U-box结构域基因或者Cbl的RING结构域基因进行基因融合,将融合基因插入真核表达载体pFLAG-CMV4,构建重组泛素连接酶。在第二部分实验中,我们检测了重组泛素连接酶在几种肿瘤细胞系中的表达和对靶蛋白的降解作用。研究的第三部分,着重考察了重组泛素连接酶对HeLa细胞的增殖和转移能力的影响。实验一:设计引物,利用普通PCR分别扩增IRS-1的ptb结构域基因、CHIP的U-box结构域基因和Cbl的RING结构域基因,ptb的下游引物与U-box、RING的上游引物设计了几个连续的反向互补序列,利用重组PCR可将ptb与U-box、ptb与RING进行基因融合,获得的产物分别命名为ptb-U-box和ptb-RING。将融合基因产物进行EcoR I、EcoR V双酶切处理,插入真核表达载体pFLAG-CMV4。经过酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒命名为pFLAG-CMV4-ptb-U-box和pFLAG-CMV4-ptb-RING,以及功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-ptb。实验二:将构建成功的重组泛素连接酶转染几种IGF-IR和InsR高表达的肿瘤细胞系,包括SK-Br-3、HepG2、HHCC以及HeLa,设立pFLAG-CMV4-ptb- U-box和pFLAG-CMV4-ptb-RING为实验组,功能结构域缺失的pFLAG-CMV4-ptb和空载体pFLAG-CMV4为阴性对照,检测重组泛素连接酶在其中的表达,以及对靶蛋白水平的下调情况,结果显示两种重组泛素连接酶均能促使靶蛋白发生不同程度的下调。同时设计引物,进行Real-time PCR实验,检测重组泛素连接酶的导入,对靶蛋白的mRNA水平是否造成影响,以确定靶蛋白丰度的降低是在翻译后水平产生的。实验三:随后选取了降解效果最明显的HeLa细胞进行细胞学实验,设立pFLAG-CMV4-ptb-U-box和pFLAG-CMV4-ptb-RING为实验组,pFLAG-CMV4 -ptb、和pFLAG-CMV4为阴性对照,MTT比色实验、平板克隆形成实验检测重组泛素连接酶对肿瘤细胞的增殖能力的影响,Transwell实验检测其对细胞转移侵袭能力的影响。结果显示,两种重组泛素连接酶能够明显的抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭能力。综上所述,在多种肿瘤细胞中都存在RTK的异常活化和过度表达,靶向降解这些分子是行之有效的抑制肿瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成员,参与肿瘤细胞的恶性转化。它们的下调能够抑制肿瘤的发展,所以成为肿瘤治疗中的理想靶位。泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,经典的泛素化修饰介导蛋白质的泛素-蛋白酶体降解途径,使被修饰的底物蛋白发生降解。利用能够特异结合IGF-1R和InsR的接头分子的受体结合域实现重组泛素连接酶的靶向性,E3泛素连接酶的催化域实现

关键词：胰岛素样生长因子受体胰岛素受体 ptb结构域 U-box结构域 RING结构域肿瘤基因治疗靶向性泛素化