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中国病原生物学杂志 2020年第11期15卷 1257-1261页

作者：翟凯新刘丽婷陈晓文陈越高婧华吴利先大理大学基础医学院微生物与免疫学教研室云南大理671000

目的构建鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白的重组质粒并诱导表达和纯化,观察其对Ana-1系巨噬细胞凋亡的影响。方法在GenBank中查找到鸟分枝杆菌编码PPE25-MAV蛋白的mav-2928基因序列,合成全基因并构建质粒。将质粒亚克隆至表达载体pET-32a(+)上... 详细信息

目的构建鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白的重组质粒并诱导表达和纯化,观察其对Ana-1系巨噬细胞凋亡的影响。方法在GenBank中查找到鸟分枝杆菌编码PPE25-MAV蛋白的mav-2928基因序列,合成全基因并构建质粒。将质粒亚克隆至表达载体pET-32a(+)上,构建重组表达质粒pET-32a-ppe25,转入感受态细胞BL21(DE3)后,通过IPTG诱导表达融合蛋白ppe25-mav。用Ni Resin FF纯化蛋白,并作用于巨噬系Ana-1细胞,流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞凋亡率并且分析其变化。结果鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白表达载体构建成功,转化至BL21(DE3)后经IPTG诱导表达约59ku的蛋白,与预期大小相符;Western blot检测该蛋白能被His抗体识别。用纯化的PPE25-MAV蛋白作用小鼠巨噬系Ana-1细胞,与空白对照组相比,作用2h后细胞的早期凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),细胞的晚期凋亡率和总凋亡率在0.5μg/ml与1μg/ml时均低于空白组(P0.05),细胞晚期凋亡率和总凋亡率在2μg/ml和5μg/ml时显著降低(P0.05)。结论重组质粒诱导表达的PPE25-MAV蛋白存在于上清和包涵体中,但主要以包涵体形式表达。纯化的PPE25-MAV蛋白对巨噬细胞凋亡有抑制作用,且主要作用于巨噬细胞的晚期凋亡阶段。

关键词：鸟分枝杆菌 PPE25-MAV蛋白 Ana-1巨噬细胞细胞凋亡

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PPE25-MAV蛋白诱导小鼠免疫细胞凋亡机制的初步研究

PPE25-MAV蛋白诱导小鼠免疫细胞凋亡机制的初步研究

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作者：陈晓文大理大学

学位级别：硕士

目的:鸟结核分枝杆菌（Mycobacterium avium,mav）是目前最为普遍和常见的一种致病性非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria,NTM）,寻找mav的致病因子并研究其相关致病机制,对于防治mav和研究新疫苗均有重要意义。PE/ppe家族蛋... 详细信息

目的:鸟结核分枝杆菌（Mycobacterium avium,mav）是目前最为普遍和常见的一种致病性非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria,NTM）,寻找mav的致病因子并研究其相关致病机制,对于防治mav和研究新疫苗均有重要意义。PE/ppe家族蛋白主要分布在致病性分枝杆菌中,可调节宿主的先天免疫反应,与致病性分枝杆菌的发病机制有关,并可作为潜在的疫苗成分。本研究运用生物信息学方法分析PPE25-MAV蛋白的结构与功能,诱导表达并纯化得到纯化的PPE25-MAV蛋白,初步探索PPE25-MAV蛋白在体内与体外诱导小鼠免疫细胞的凋亡情况和免疫学机制。方法:1.从NCBI数据库获取mav＿2928基因编码的蛋白的氨基酸序列信息;运用在线数据库或软件预测分析PPE25-MAV蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、亚细胞定位、蛋白跨膜区、蛋白磷酸化位点、结构和抗原表位。2.探索较佳表达条件,诱导重组质粒大量表达PPE25-MAV蛋白,并利用镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化。3.纯化的PPE25-MAV蛋白用于体外作用小鼠脾脏淋巴细胞,以及给BALB/c小鼠皮下注射和腹腔注射纯化的PPE25-MAV蛋白后分别提取小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,并用Western Blot检测细胞NLRP3、ASC、caspase1-p20以及凋亡相关蛋白caspase3、8、9的表达量。4.ELISA检测小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量。结果:1.生物信息学分析发现mav＿2928基因的全长为1266bp,编码的PPE25-MAV蛋白包含421个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白,脂肪系数为72.66,无信号肽及跨膜区,大概率位于细菌细胞膜上;有52个磷酸位点和1个保守域结构;二级结构以无规则卷曲为主,是一个单体蛋白,结构相对疏松;预测了ppe25-mav含有7个B细胞的优势抗原表位以及24个Th细胞表位。2.成功表达并纯化到目的蛋白并鉴定为PPE25-MAV蛋白。3.PPE25-MAV蛋白经皮下注射和腹腔注射给小鼠后可分别引起小鼠脾脏淋巴细胞凋亡和腹腔巨噬细胞凋亡,在体外实验中主要是引起小鼠脾脏淋巴细胞的晚期凋亡。4.PPE25-MAV蛋白可激活小鼠脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体,相关分子NLRP3、ASC和caspase1-p20表达增加,炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α分泌量增加,凋亡途径相关的caspase分子caspase8以及caspase3、9活化片段增加。结论:1.PPE25-MAV蛋白具备多个磷酸化位点在参与细胞信号的转导中起重要作用,含有7个B细胞优势的抗原表位和多个Th和CTL细胞抗原表位,为该蛋白作为候选疫苗抗原提供了理论基础。2.成功表达并纯化得到的PPE25-MAV蛋白能诱导小鼠脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞凋亡,炎性细胞因子表达量增加,并激活NLRP3炎症小体,引起炎症反应。3.PPE25-MAV蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏淋巴细胞凋亡的免疫学机制主要是通过激活caspase9并切割下游的caspase3形成cleavd-caspase3降解细胞必需的生存底物导致细胞凋亡。

关键词：鸟分枝杆菌 PPE25-MAV蛋白细胞凋亡炎症小体

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