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pink1/Parkin介导的线粒体自噬在溃疡性结肠炎发病中的作用

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PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在溃疡性结肠炎发病中的作用

作者：张盼河北医科大学

学位级别：硕士

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性、复发性的非特异性炎症性疾病。以腹痛、腹泻、粘液脓血便为主要临床表现。近年来,我国UC的发病率逐渐上升,严重影响了病人的生活质量,增加了经济负担,且存在癌变的风险。目前,UC的病因... 详细信息

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性、复发性的非特异性炎症性疾病。以腹痛、腹泻、粘液脓血便为主要临床表现。近年来,我国UC的发病率逐渐上升,严重影响了病人的生活质量,增加了经济负担,且存在癌变的风险。目前,UC的病因及其发病机制尚不明确,氧化应激(oxidative stress,OS)与线粒体功能紊乱可能在UC患者的发病过程中起到一定作用。自Lemasters于2005年提出线粒体自噬概念以来,很多研究证明其与多种疾病有关,如帕金森病、特发性肺纤维化等。目前线粒体自噬研究较多的是pink1/Parkin。正常情况下,pink1定位于线粒体,在线粒体外膜转位蛋白(translocase of the outer mitochondrial membrane,TOM)复合物及线粒体内膜转位蛋白(translocase of the inner mitochondrial membrane,TIM)复合物的作用下进入线粒体内膜inner mitochondrial membrane,IMM),被线粒体蛋白酶降解。线粒体作为氧化应激的主要影响成分之一,在氧化应激下导致线粒体受损发生去极化,使pink在线粒体内的降解受阻,从而聚集于线粒体外膜(outermitochondrial membrane,OMM),进一步磷酸化Parkin使其募集于OMM,启动线粒体自噬。线粒体自噬不但可以清除受损的线粒体,维持线粒体的动态平衡,而且可以减少受损线粒体产生的过量线粒体反应活性氧类(mitochondrial reactive oxygen species),减轻细胞损伤。自噬被认为是一种保护机制对抗UC的炎症损伤。线粒体自噬也被认为与炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)有关。目前尚无pink1/Parkin调节的线粒体自噬在UC中作用的研究。目的:检测UC患者结肠粘膜是否发生线粒体自噬,线粒体自噬相关蛋白pink1、Parkin的表达情况及其是否与UC严重程度有关。方法:1收集确诊为UC活动期患者33例作为实验组,并按照改良Mayo评分将其分为轻、中、重三组,每组各11例。结肠息肉患者11例作为对照组。2经结肠镜下取直-乙交界处结肠黏膜4块,采用HE染色显微镜下观察结肠粘膜组织病理学表现,透射电镜观察结肠粘膜线粒体自噬情况,免疫组化及Western blot方法检测结肠粘膜pink1、Parkin蛋白的表达情况。应用SPSS13.0采用方差分析对数据进行统计学分析。结果:1 HE染色结果对照组结肠黏膜上皮结构完整,腺体细胞排列整齐,杯状细胞较多,可见少量炎性细胞浸润;UC各组黏膜可见大量炎性细胞浸润,隐窝结构紊乱,腺体变形、排列紊乱、数目减少,另外隐窝内及隐窝上皮均可见大量中性粒细胞浸润,伴杯状细胞减少,可出现黏膜上皮脱落或缺失。2透射电镜技术UC病人结肠粘膜组织均可发现线粒体的破坏,如线粒体肿胀,脊紊乱、水肿、消失,并可发现线粒体自噬现象,而对照组结肠粘膜组织线粒体形态结构正常,未观察到线粒体自噬。3免疫组织化学染色显示结肠粘膜组织中pink1、Parkin的表达对照组结肠粘膜中pink1和Parkin在胞质中呈棕黄色表达,而UC组胞质内呈深棕色表达,且表达量较对照组增加,统计学分析pink1表达的积分光密度值(integrated optical density,IOD)为轻度(92372±17550)>中度(71405±1922)>重度(54203±3574)>对照组(31944±25323),任意两组比较P1114)>中度(42160±7798)>重度(24262±1140)>对照组(16274±2463),任意两组比较差别有统计学意义(Ppink1、Parkin的表达UC组与对照组比较pink1、Parkin表达均上调,pink1表达统计学分析为轻度(0.3795±0.0108)>中度(0.3484±0.0104)>重度(0.3249±0.0180)>对照组(0.2832±0.0479),任意两组比较P19±0.0039)>中度(0.2910±0.0132)>重度(0.2448±0.0381)>对照组(0.1906±0.0100),任意两组比较差别有统计学意义(P1 UC患者线粒体形态结构破坏,且发生了线粒体自噬现象。2 UC患者结肠黏膜组织中线粒体自噬相关蛋白pink1、Parkin的表达增多,且随疾病的严重程度的增加而下降。pink1/Parkin介导的线粒体自噬可能在UC的发生发展中起到一定作用,且其表达水平与UC的严

关键词：溃疡性结肠炎氧化应激线粒体自噬 pink1 Parkin

pink1/parkin介导的线粒体自噬功能障碍在SCA3/MJD发病中的作用机制研究

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PINK1/parkin介导的线粒体自噬功能障碍在SCA3/MJD发病中的作用机...

作者：柏杖勇桂林医学院

学位级别：硕士

目的：研究ataxin-3是否参与了对pink1/Parkin介导的线粒体自噬的调控;明确野生型和突变型ataxin-3对pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响;阐述pink1/Parkin介导的线粒体自噬功能障碍在SCA3/MJD发病机制中的作用。方法:以体外人工培养... 详细信息

目的：研究ataxin-3是否参与了对pink1/Parkin介导的线粒体自噬的调控;明确野生型和突变型ataxin-3对pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响;阐述pink1/Parkin介导的线粒体自噬功能障碍在SCA3/MJD发病机制中的作用。方法:以体外人工培养细胞为模型，通过目标质粒转染、相关药物等干预、应用免疫荧光-激光共聚焦技术明确ataxin-3是否参与pink1/parkin介导的线粒体自噬途径的降解。应用werstem blot技术研究野生型、polyQ扩展突变型ataxin-3对pink1蛋白以及线粒体蛋白降解的影响。抑制自噬-溶酶体途径、蛋白酶体途径后，野生型以及polyQ扩展突变型ataxin-3对pink1蛋白降解的影响。结果：免疫荧光-激光共聚焦结果显示：pink1蛋白定位于细胞质，模拟线粒体损伤的条件下，pink1的蛋白聚集体在细胞内分布有所改变，但pink1完全不能转移到细胞核内，线粒体部分聚集，不同程度地与pink1共定位。在野生型ataxin-3干预组，pink1蛋白聚集体定位于细胞核;而Poly Q扩展突变型ataxin-3组中，pink1聚集体定位于细胞核。J功能区突变的野生型ataxin-3干预组中，在模拟线粒体损伤后，pink1和线粒体蛋白明显聚集，两者出现明显共定位;而在J功能区突变的polyQ扩展突变型ataxin-3干预组组中，pink1蛋白和线粒体蛋白也出现部分聚集，部分共定位。分别单独转染野生型ataxin－324Q和Poly Q扩展突变型ataxin-384Q，无论使用CCCP,3-MA,MG-132干预，野生型ataxin－324Q蛋白聚集体始终定位于细胞核。在野生型ataxin－324Q组中，抑制自噬-溶酶体通路，野生型ataxin－324Q和线粒体蛋白明显聚集与细胞核周，呈现明显的共定位;抑制泛素-蛋白酶体通路后模拟线粒体损伤,野生型ataxin－324蛋白聚集体明显减少。 Poly Q扩展突变型ataxin-384Q组中，无论使用CCCP,3-MA, MG-132处理，Poly Q扩展突变型ataxin-384Q蛋白聚集体始终定位于细胞质，在抑制自噬-溶酶体通路后模拟线粒体损伤，polyQ扩展突变型ataxin-384Q蛋白聚集体明显减少;抑制泛素-蛋白酶体通路后模拟线粒体损伤，polyQ扩展突变型ataxin-384Q蛋白聚集体和线粒体蛋白均较前更加聚集，两者明显共定位。western blot显示：非药物干预条件下，与单独表达pink1组相比，ataxin-3干预组pink1、线粒体蛋白均明显减少，尤其以ataxin-378Q组pink1蛋白、线粒体蛋白减少明显。模拟线粒体损伤后，pink1蛋白、线粒体蛋白均较干预前明显减少;而在ataxin-378Q组中，pink1、线粒体蛋白减少更明显。抑制细胞自噬-溶酶体途径，与非ataxin-3干预组相比,无论是野生型ataxin-324Q组还是polyQ扩展突变型ataxin-378Q组pink1蛋白均较较非ataxin-3组减少，polyQ扩展突变型ataxin-378Q组较少更明显;在抑制自噬-溶酶体后，非ataxin-3组线粒体明显增加，ataxin-3处理组线粒体蛋白较前明显减少，两组间无差异。抑制泛素-蛋白酶体途径，与抑制蛋白酶体途径前相比，无论对照组还是ataxin-3干预组，pink1蛋白较前增加，尤其以ataxin-324Q组增加明显。抑制泛素-蛋白酶体通路，pink1组线粒体较前明显减少;而野生型ataxin-3干预组线粒体蛋白无明显变化，而polyQ扩展突变型ataxin-3组线粒体蛋白明显增加。结论：pink1蛋白与线粒体蛋白的代谢趋势基本一致。无论是野生型还是polyQ扩展突变型ataxin-3都可影响pink1蛋白通过泛素-蛋白酶体通路以及自噬-溶酶体通路代谢。当自噬被抑制后，无论野生型还是polyQ扩展突变型ataxin-3组pink1均可通过泛素-蛋白酶体通路代谢。当抑制泛素-蛋白酶体通路后，野生型ataxin-3组pink1不能通过自噬-溶酶体通路代谢;polyQ扩展突变型ataxin-3组pink1可通过自噬-溶酶体通路代谢，线粒体蛋白不能通过自噬-溶酶体通路代谢。线粒体方面，在降低线粒体膜电位时，线粒体蛋白自噬较为完全，而抑制泛素时，polyQ扩展突变型ataxin-3失去向自噬-溶酶体通路转化的能力，从而造成过度自噬或者不能自噬，这可能就是SCA3/MJD的发病机制的一个方面。

关键词：线粒体自噬 parkin pink1 ataxin-3 autophagy

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pink1活性检测荧光探针的设计与开发

PINK1活性检测荧光探针的设计与开发

作者：孙慧敏天津大学

学位级别：硕士

线粒体自噬调节障碍是引发帕金森氏症(Parkinson’s Disease,PD)的原因之一,该疾病在世界范围内引起大量发病和死亡。研究表明,pink1/Parkin在线粒体自噬调节中起着至关重要的作用,其基因突变会引发家族性的、常染色体隐性遗传的帕金森... 详细信息

线粒体自噬调节障碍是引发帕金森氏症(Parkinson’s Disease,PD)的原因之一,该疾病在世界范围内引起大量发病和死亡。研究表明,pink1/Parkin在线粒体自噬调节中起着至关重要的作用,其基因突变会引发家族性的、常染色体隐性遗传的帕金森氏症。PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,pink1)可响应线粒体的损伤而被募集至线粒体外膜,招募并磷酸化E3泛素连接酶(Parkin)以及泛素(Ubiquitin,Ub),受损伤的线粒体通过泛素-蛋白酶体系统被降解,从而维持细胞内环境的稳定。然而,到目前为止,人们对pink1如何感应线粒体的损伤并被募集至线粒体外膜、pink1在细胞中被激活的分子机制及具体定位、pink1活化后如何将Parkin和Ub募集至线粒体外膜等问题还不清楚。造成这一困境的一个重要原因是缺乏可用于动态标记、追踪pink1的有效生物学手段,难以系统研究分析其相关分子机制。本研究拟开发一种新颖的、可视地在体内检测pink1浓度以及活性的探针。该探针将循环置换的绿色荧光蛋白(Circular permutated enhance green fluorescent protein,cp EGFP)与Parkin、Ub融合表达。由于Ub的Ser65被pink1磷酸化后会与Parkin结合,从而使原本丧失荧光信号的cp EGFP重新发出绿色荧光,其荧光的强弱可反映pink1的浓度与活性。实验结果显示,探针的荧光信号会随着pink1浓度的升高而增强。本论文首次发现可能存在pink1、Parkin以及Ub三元复合物,为该三元复合物的结构研究打下基础。后续实验中,我们将继续对探针进行优化,并在细胞内验证其有效性,以期为pink1活化的分子机制研究提供有效工具,并为帕金森氏症的早期分子诊断提供新思路。

关键词： pink1 pink1/Parkin通路 cpEGFP 荧光探针

Parkin、pink1、DJ-1和线粒体功能障碍与帕金森病

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生命科学 2010年第10期22卷 1009-1012页

作者：杨辉左伋刘雯复旦大学上海医学院细胞与遗传医学系上海200032

帕金森病(Parkinson’s disese,PD)是一种常见的神经退行性疾病,但到目前为止发病机制尚不明确,环境和遗传等因素与其发病有密切关系。研究表明,蛋白质异常积聚(泛素/蛋白酶体途径)和线粒体氧化损伤(线粒体途径),可能是导致PD患者发病... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disese,PD)是一种常见的神经退行性疾病,但到目前为止发病机制尚不明确,环境和遗传等因素与其发病有密切关系。研究表明,蛋白质异常积聚(泛素/蛋白酶体途径)和线粒体氧化损伤(线粒体途径),可能是导致PD患者发病的关键分子机制。Parkin、pink1和DJ-1等基因突变与常染色体隐性的家族性PD有关,这些相关基因编码的蛋白对于维持线粒体形态和功能起着重要的作用。本文将主要从Parkin、pink1、DJ-1和线粒体功能障碍与帕金森病的关系进行综述。

关键词： Parkin pink1 DJ-1 线粒体功能障碍帕金森病

pink1/Parkin介导的线粒体自噬分子机制

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中国细胞生物学学报 2017年第7期39卷 939-946页

作者：汤友静牛玉娜王辉新乡医学院免疫学研究中心新乡453003 河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心新乡453003

线粒体自噬作为一种选择性清除受损线粒体的特异性自噬类型,是细胞内线粒体的质量控制体系,其活性受多种途径调控。近年来,关于线粒体自噬的调控及其对生理、病理方面的影响受到众多研究者的关注,并获得了显著的研究成果。研究表明,人P... 详细信息

线粒体自噬作为一种选择性清除受损线粒体的特异性自噬类型,是细胞内线粒体的质量控制体系,其活性受多种途径调控。近年来,关于线粒体自噬的调控及其对生理、病理方面的影响受到众多研究者的关注,并获得了显著的研究成果。研究表明,人PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,pink1)/Parkin通路调控线粒体动力学过程,并介导受损线粒体的自噬性清除。pink1/PARK2基因缺失或突变是神经退行性疾病的重要发病机制之一,其功能异常也与多种肿瘤的发生有关。该综述主要介绍了pink1/Parkin蛋白质的生化特性、介导线粒体自噬发生的分子机制及其对细胞生物学进程的影响。

关键词： pink1 Parkin 线粒体自噬分子机制

pink1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇模型神经变性的影响及其作用机制的研究

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PINK1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇模型神经变性的影响及其作用...

作者：魏小莉桂林医学院

学位级别：硕士

目的：研究帕金森病相关蛋白在SCA3/MJD发病机制中的作用,并进一步验证pink1表达下调抑制SCA3/MJD转基因果蝇神经变性是否需要依赖泛素-蛋白酶体通路和蛋白聚集体-自噬通路。方法：用携带PD相关蛋白的果蝇分别干预GMR-GAL4/UAS系统的SCA... 详细信息

目的：研究帕金森病相关蛋白在SCA3/MJD发病机制中的作用,并进一步验证pink1表达下调抑制SCA3/MJD转基因果蝇神经变性是否需要依赖泛素-蛋白酶体通路和蛋白聚集体-自噬通路。方法：用携带PD相关蛋白的果蝇分别干预GMR-GAL4/UAS系统的SCA3/MJD转基因果蝇模型,并分别在光镜和电镜下观察果蝇眼睛的特点,然后,分别抑制泛素-蛋白酶体通路、蛋白聚集体-自噬通路,观察pink1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇模型复眼的作用。结果：一方面,pink1过表达或完全敲除显著加重了SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经变性,而pink1表达下调却显著改善了该果蝇模型的神经变性;另一方面,Parkin过表达、表达下调以及Parkin突变均明显加重了SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经变性,而抑制泛素-蛋白酶体通路或蛋白聚集体-自噬通路后,pink1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用明显减弱。结论：pink1和Parkin参与了对突变ataxin-3毒性机制的调控,pink1过表达或完全缺失增加了突变ataxin-3的毒性,而其表达下调则通过泛素-蛋白酶体通路和蛋白聚集体-自噬通路降低了突变ataxin-3的神经细胞毒性,抑制了SCA3/MJD转基因果蝇的神经变性;另一方面,Parkin表达量的改变以及Parkin突变均加重了突变ataxin-3的毒性,提示具有正常功能的Parkin对维持SCA3/MJD转基因果蝇神经细胞稳定性至关重要。

关键词： SCA3/MJD转基因果蝇模型 pink1 Parkin 共济失调蛋白

pink1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用及蛋白降解的关系研究

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PINK1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用及蛋白降解的...

作者：莫晔桂林医学院

学位级别：硕士

目的：为研究pink1表达下降在SCA3/MJD转基因果蝇中的神经保护作与毒性蛋白降解的关系。方法：利用Gmr-GAL4、Elav-gal4系统构建在复眼及神经系统，致病蛋白为SCA3/MJD转基因果蝇模型上选择性表达。使pink1表达下调干预SCA3/MJD转基因... 详细信息

目的：为研究pink1表达下降在SCA3/MJD转基因果蝇中的神经保护作与毒性蛋白降解的关系。方法：利用Gmr-GAL4、Elav-gal4系统构建在复眼及神经系统，致病蛋白为SCA3/MJD转基因果蝇模型上选择性表达。使pink1表达下调干预SCA3/MJD转基因果蝇观察复眼及神经系统的致病情况，同时用Gmr-GAL4系统启动正常果蝇即MJDtr-Q27，使这3种果蝇进行观察对照。在光镜和电镜下观察使用Gmr-GAL4系统启动各组果蝇眼睛的特点，线粒体ATP值的测定。Gmr-gal4、Elav-gal4系统启动各组果蝇后运用Western blotting检测各组细胞ataxin一3毒性蛋白的表达情况。结果：发现pink1表达下调显著改善了SCA3/MJD转基因果蝇，其眼部平整程度、纹路、色素脱失情况及副眼结构明显好转，ATP值明显增高，提示果蝇在线粒体功能明显改善。运用Western blotting检测各组果蝇ataxin一3毒性蛋白的表达，发现pink1表达下调明显降低了ataxin一3蛋白毒性。结论：利用Gmr-gal4、Elav-gal4启动子观察各组果蝇的复眼，线粒体ATP值的测定以及Western blotting检测果蝇ataxin一3，pink1表达下调具有线粒体保护功能，pink1表达下调有效的降解了Ataxin-3毒性蛋白。我们得出pink1表达下调对SCA3/MJD转基因果蝇具有神经保护作用。

关键词： SCA3/MJD转基因果蝇模型 pink1 蛋白神经保护

Defective mitophagy and the etiopathogenesis of Alzheimer’s disease

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Translational Neurodegeneration 2022年第1期11卷 461-473页

作者： Kuan Zeng Xuan Yu Yacoubou Abdoul Razak Mahaman Jian-Zhi Wang Rong Liu Yi Li Xiaochuan Wang Department of Psychiatry Wuhan Mental Health CenterWuhan 430012China Co-Innovation Center of Neurodegeneration Nantong UniversityNantong 226001China Department of Pathophysiology School of Basic MedicineKey Laboratory of Education Ministry/Hubei Province of China for Neurological DisordersTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and TechnologyWuhan 430030China Wuhan Hospital for Psychotherapy Wuhan 430012China Shenzhen Huazhong University of Science and Technology Research Institute Shenzhen 518000China.

Accumulation of impaired mitochondria and energy metabolism disorders are non-negligible features of both aging and age-related neurodegeneration,including Alzheimer’s disease(AD).A growing number of studies suggest that mitophagy disorders play an important role in AD occurrence and development.The interaction between mitophagy deficits and Aβor Tau pathology may form a vicious cycle and cause neuronal damage and death.Elucidating the molecular mechanism of mitophagy and its role in AD may provide insights into the etiology and mechanisms of AD.Defective mitophagy is a potential target for AD prevention and treatment.

关键词： Mitophagy Alzheimer’s disease pink1 Tau Aβ

pink1/Parkin在肥胖小鼠白色脂肪组织及在棕榈酸处理的3T3-L1细胞中的作用及机制研究

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PINK1/Parkin在肥胖小鼠白色脂肪组织及在棕榈酸处理的3T3-L1细胞...

作者：崔晨山东大学

学位级别：硕士

研究背景肥胖(obesity)是一种能量失衡所导致的慢性代谢性疾病,其常伴发2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心脑血管疾病、睡眠呼吸暂停综合征等疾病,并与数种肿瘤的发生有密切的关系,同时还与全因死亡率的增加具有一定程度的相关性,近年来肥... 详细信息

研究背景肥胖(obesity)是一种能量失衡所导致的慢性代谢性疾病,其常伴发2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心脑血管疾病、睡眠呼吸暂停综合征等疾病,并与数种肿瘤的发生有密切的关系,同时还与全因死亡率的增加具有一定程度的相关性,近年来肥胖的全球发病率逐年升高,已然成为全球公共卫生面临的巨大挑战。白色脂肪组织作为机体一种主要的能量储存器官,在营养性肥胖的发生发展过程中起着重要作用。在脂肪细胞分化以及进行脂肪储存及脂肪动员过程中,线粒体作为一种调节能量代谢的细胞器发挥着重要作用,故维持其稳态平衡状态十分重要。然而由于其功能的特殊性,线粒体在肥胖发生过程中极易受到氧化应激的损伤。目前已有文献报道,能量过剩所致的代谢应激使白色脂肪组织中线粒体产生过多的活性氧簇,并无法及时清除,反过来会造成线粒体的损伤,影响脂肪细胞的功能,从而加重肥胖。另有文献介绍,损伤的线粒体经过细胞内一定的修复机制,有些可与其他线粒体融合生成新的功能完整的线粒体,而另有一些无法被修复的线粒体则会通过pink1(PTEN-induced putative kinase 1)-Parkin 通路介导的线粒体自噬,被细胞溶酶体分解再利用。线粒体自噬可以维持细胞内具有一定数量的较高的质量的线粒体,从而保障了细胞的整体功能。pink1是一种核编码的线粒体蛋向,当线粒体功能正常时,pink1分子会被线粒体内膜蛋白剪切酶PARL(presenilins-associated rhomboid-like protein)分解失活,而当线粒体功能受损无法修复并导致其膜电位下降时,胞浆中的pink1分子会聚集到受损线粒体的表面,并招募其下游分子Parkin以及一些自噬相关分子。Parkin是一种E3泛素连接酶,在接受pink1激活信号后,可从胞浆逐渐转移到线粒体膜表面,然后招募微管相关蛋白1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白家族,逐渐形成线粒体自噬小体,并被溶酶体所降解,从而使受损的线粒体被清除。总体而言,pink1/Parkin可以通过线粒体自噬来保障细胞内线粒体整体功能水平,对细胞具有一定的保护作用,但是在能量过剩引起代谢应激的前提下,pink1/Parkin信号通路是否参与保护脂肪细胞的功能尚未可知。因此研究pink1/Parkin信号通路对于明确脂肪细胞在能量过剩的条件下维持其基本功能的机理十分重要,或为肥胖的治疗提供一种新的思路。研究目的A.明确pink1/Parkin在高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织中的表达情况。B.明确pink1/Parkin对棕榈酸处理的3T3-L1细胞线粒体功能的影响。C.明确pink1/Parkin对棕榈酸处理的3T3-L1细胞凋亡的影响。研究方法(一)动物处理1.本研究选用4周龄的雄性C57BL/6J小鼠。在适应饲养环境后,45只小鼠随机分为普通饮食对照组(CTRL)15只和高脂饮食组(HFD)30只,分别喂养12周,每周测量并记录体重。2.分别在第11周和12周进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT),腹腔胰岛素耐量试验(IPITT)。3.在喂养即将结束时,用双能X线检测小鼠体脂含量,验证造模成功。之后,麻醉小鼠,心尖取血测血脂等生化指标,取小鼠腹部皮下脂肪、附睾旁内脏脂肪。4.通过透射电子显微镜观察脂肪组织中线粒体形态结构。5.通过qPCR、Western blot检测pink1/Pakin等相关蛋白的表达情况。(二)细胞培养1.用含有10%的胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基培养3T3-L1细胞。2.用 Lipofectamine2000 转染 pink1/Parkin 的小干扰 RNA。3.用不同浓度的棕榈酸溶液刺激细胞48h,之后用qPCR、Western blot检测不同条件处理的细胞各种目的基因、蛋白的表达情况。4.细胞凋亡检测:使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测不同处理条件下细胞凋亡的情况。5.细胞免疫荧光染色:将不同刺激条件处理后的细胞接种在细胞爬片上面,固定后,一抗二抗孵育,封片,镜下观察。6.线粒体功能的检测:将不同刺激条件处理后的细胞用ROS检测试剂盒、ATP检测试剂盒、JC-1检测试剂盒进行检测。研究结果1.pink1/Parkin信号通路在肥胖小鼠脂肪组织中被激活。2.pink1/Parkin信号通路阻止了 PA诱导的3T3-L1细胞线粒体功能下降。3.pink1/Parkin信号通路阻止了 PA诱导的3T3-L1细胞凋亡。研究结论pink1/Parkin信号通路通过维持细胞内线粒体的功能,在一定程度上保护了细胞免受代谢应激的损伤。

关键词：代谢应激 pink1 Parkin 肥胖线粒体