PINK1活性检测荧光探针的设计与开发

作     者：孙慧敏 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦晓红

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 1002[医学-临床医学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：PINK1 PINK1/Parkin通路 cpEGFP 荧光探针 

摘      要：线粒体自噬调节障碍是引发帕金森氏症(Parkinson’s Disease,PD)的原因之一,该疾病在世界范围内引起大量发病和死亡。研究表明,PINK1/Parkin在线粒体自噬调节中起着至关重要的作用,其基因突变会引发家族性的、常染色体隐性遗传的帕金森氏症。PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)可响应线粒体的损伤而被募集至线粒体外膜,招募并磷酸化E3泛素连接酶(Parkin)以及泛素(Ubiquitin,Ub),受损伤的线粒体通过泛素-蛋白酶体系统被降解,从而维持细胞内环境的稳定。然而,到目前为止,人们对PINK1如何感应线粒体的损伤并被募集至线粒体外膜、PINK1在细胞中被激活的分子机制及具体定位、PINK1活化后如何将Parkin和Ub募集至线粒体外膜等问题还不清楚。造成这一困境的一个重要原因是缺乏可用于动态标记、追踪PINK1的有效生物学手段,难以系统研究分析其相关分子机制。本研究拟开发一种新颖的、可视地在体内检测PINK1浓度以及活性的探针。该探针将循环置换的绿色荧光蛋白(Circular permutated enhance green fluorescent protein,cp EGFP)与Parkin、Ub融合表达。由于Ub的Ser65被PINK1磷酸化后会与Parkin结合,从而使原本丧失荧光信号的cp EGFP重新发出绿色荧光,其荧光的强弱可反映PINK1的浓度与活性。实验结果显示,探针的荧光信号会随着PINK1浓度的升高而增强。本论文首次发现可能存在PINK1、Parkin以及Ub三元复合物,为该三元复合物的结构研究打下基础。后续实验中,我们将继续对探针进行优化,并在细胞内验证其有效性,以期为PINK1活化的分子机制研究提供有效工具,并为帕金森氏症的早期分子诊断提供新思路。